Integrative in vitro analysis of glioblastoma resistance

Käfer, Leon (2025): Integrative in vitro analysis of glioblastoma resistance: towards mechanism-driven therapeutic optimization. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Background: Despite immense clinical and preclinical efforts, the prognosis of GBM has not been improved over decades, emphasizing the need to discover and establish new therapeutic options. A major obstacle in this regard is the strong inherent therapy resistance related to enhanced DDR signaling, subclonal heterogeneity, adaptation to hypoxia, and ferroptotic and autophagic regulatory hubs. To this end, the present thesis was conceptualized to comprehensively analyze treatment resistance of GBM at multiple molecular levels in vitro and to develop an integrative approach by which potential vulnerabilities for targeted optimization of radio- /chemotherapy can be identified. Methods: The first publication assessed the inherent treatment resistance of selected well-established human GBM cell lines by measuring clonogenic survival upon treatment with single or fractionated IR and TMZ treatment w/optional concurrent IR. Clonogenic survival data were subjected to principal component analysis (PCA) using the first principal component as the respective resistance score to the corresponding treatment. The mRNA expression levels of 38 DNA damage response regulators were assessed by quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) and subsequently subjected to correlation analysis with the obtained resistance scores. Determination of MGMT expression was based on sodium dodecyl sulfate – polyacrylamide gel (SDS-PAGE) and Western blot analyses, whereas methylome arrays assessed the methylation status of the MGMT promoter. The top hit candidates were further validated by determining clonogenic survival and DNA repair kinetics in response to (chemo-)irradiation by staining gamma H2A histone family member X (γH2AX)/ TP53-Binding Protein 1 (53BP1) foci following pharmacological inhibition. For the second publication, cell line characterization was enriched with multilevel molecular data, including spectral karyotyping, array-based comparative genomic hybridization, DNA methylation analysis, and microarray-based global gene expression profiling. To break down treatment resistance from single gene to gene set/pathway level, a multistep integration of our clonogenic survival-based resistance scores with transcriptomic profiling data was performed, followed by gene set enrichment analysis (GSEA), gene set variance analysis (GSVA), and leading edge analysis (LEA). Results: Examined cell lines exhibited variable but substantial treatment resistance, with those deficient in MGMT expression responding to TMZ, as expected. Consistently, there was robust upregulation of DDR regulators and corresponding correlation with treatment resistance, including PARP1, HSP90AB1, and nibrin (NBN), for which pharmacological inhibitors are readily available and whose impact in GBM is well-accepted. ATR and LIG4 emerged as previously underappreciated DDR regulators related to radioresistance, while ATM expression correlated with chemoresistance. Functional validation showed strong radiosensitization upon inhibition of ATR, in contrast to LIG4, and documented slight but non-significant sensitization to TMZ treatment upon inhibition of ATM. In the second publication, the spectrum of potential targets for pharmacological inhibition was comprehensively broadened. Integrating resistance scores with global transcriptome profiling data pinpointed 14 molecular correlates with treatment resistance, such as proteasome 20S subunit beta 3 (PSMB3), lactosylceramide alpha 1,4-galactosyltransferase (A4GALT), and DNA polymerase alpha 1 catalytic subunit (POLA1). By matching our mRNA expression data with the Cancer Gene Consensus (CGC) gene collection, we identified androgen receptor (AR), STAT5B, and MAP2K4, which positively correlate with treatment resistance and are known contributors to GBM progression, with readily available inhibitors. At gene set level, GSEA identified 21 positively and 14 negatively enriched gene sets, with the ROS pathway, mTORC1 signaling, and TNFα via nuclear factor kappa B (NF-κB) signaling emerging as key drivers of inherent treatment resistance, implicated in the ROS-autophagy-ferroptosis axis. This confirmed the involvement of the ROS-autophagy-ferroptosis axis in treatment resistance, and LEA of these gene sets revealed 14 potential drug targets, including glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD), solute carrier family 7 member 11 (SLC7A11), proteasome assembly chaperone 1 (PSMG1), proteasome 20S subunit alpha 1 (PSMA1), and thioredoxin reductase 1 (TXNRD1). Conclusion: In this study, we provide an in-depth investigation of the molecular drivers behind therapy resistance in human GBM cells, broadening the scope for targeted therapeutic strategies and validating the efficacy and feasibility of our multi-level integrative approach. The data sets supporting this work are of potential value for in-depth research in treatment resistance. Beyond this, our systematic workflow can be readily applied to other data sets and tumor types.

Abstract

Hintergrund: Trotz intensiver klinischer und präklinischer Bemühungen hat sich die Prognose des Glioblastoms über Jahrzehnte nicht verbessert, was die Dringlichkeit unterstreicht, neue Therapieoptionen zu identifizieren und zu evaluieren. In diesem Kontext stellt die starke inhärente Therapieresistenz ein signifikantes Hindernis dar, das mit verstärkter DNA-Schadensantwort, subklonaler Heterogenität, der Anpassung an Hypoxie sowie ferroptotischen und autophagischen regulatorischen Achsen in Zusammenhang steht. Die vorliegende Arbeit wurde konzipiert, um die Behandlungsresistenz von Glioblastomzellen auf mehreren molekularen Ebenen in vitro umfassend zu analysieren und einen integrativen Ansatz zu entwickeln, mit dem potenzielle Schwachstellen für eine gezielte Optimierung der Radiochemotherapie identifiziert werden können. Methoden: In der ersten Publikation wurde die inhärente Behandlungsresistenz ausgewählter etablierter humaner Glioblastomzelllinien durch Messung des klonogenen Überlebens nach Behandlung mit einzeitiger oder fraktionierter Bestrahlung sowie nach Temozolomid-Behandlung mit optionaler gleichzeitiger Bestrahlung evaluiert. Die Daten zum klonogenen Überleben wurden einer Hauptkomponentenanalyse unterzogen, wobei die erste Hauptkomponente als Resistenzwert für die entsprechende Behandlung verwendet wurde. Die mRNA-Expressionsniveaus von 38 Regulatoren der DNA-Schadensantwort wurden durch quantitative qRT-PCR bewertet und anschließend einer Korrelationsanalyse mit den erhaltenen Therapie-Resistenzwerten unterzogen. Die Bestimmung der MGMT-Expression basierte auf SDS-PAGE und Western-Blot-Analysen, während Methylom-Arrays den Methylierungsstatus des MGMT-Promotors bewerteten. Die Top-Treffer wurden weitergehend validiert, indem das klonogene Überleben und die DNA-Reparaturkinetik nach Radio(chemo)therapie durch Anfärben von γH2AX/TP53-BP1-Foci bestimmt wurden. Für die zweite Publikation wurde die Zellliniencharakterisierung um multi-level molekulare Daten erweitert, darunter spektrale Karyotypisierung, Array-basierte vergleichende genomische Hybridisierung, DNA-Methylierungsanalyse und Microarray-basierte Genexpressionsprofile. Um die Behandlungsresistenz vom einzelnen Gen bis zur Ebene der Gensets/Signalwege aufzuschlüsseln, wurde eine multi-level Integration unserer auf dem klonogenen Überleben basierenden Resistance Scores mit transkriptomischen Profildaten durchgeführt, gefolgt von einer Geneset-Enrichment-Analyse(GSEA), einer Geneset-Varia(on-Analyse (GSVA) und einer Leading-Edge-Analyse (LEA). Ergebnisse: Die untersuchten Zelllinien wiesen eine variable, jedoch signifikante Behandlungsresistenz auf, wobei diejenigen mit niedriger MGMT-Expression, wie erwartet, auf TMZ ansprachen. Zudem konnte eine konsistente, robuste Hochregulierung von DNA-Schadensreparatur-Regulatoren beobachtet werden, die in einer entsprechenden Relation zur Behandlungsresistenz stand. Hierzu zählten u.a. PARP1, HSP90AB1 und NBN, für die pharmakologische Inhibitoren bereits verfügbar sind und deren Bedeutung beim Glioblastom allgemein anerkannt ist. Darüber hinaus konnten ATR und LIG4 im Zusammenhang mit der Strahlenresistenz bzw. ATM-Expression mit der Chemoresistenz als bisher unterschätzte DNA-Schadensreparatur-Regulatoren identifiziert werden. Die funktionelle Validierung ergab eine starke Radiosensibilisierung nach der Hemmung von ATR (anders als bei LIG4) und dokumentierte eine leichte, allerdings nicht signifikante Sensibilisierung für TMZ-Behandlung nach ATM-Hemmung. In der zweiten Publikation wurde das Portfolio potenzieller Ziele für die pharmakologische Hemmung umfassend erweitert. Durch die Integration von Resistance Scores mit globalen Transkriptom-Daten wurden 14 molekulare Korrelatoren der Behandlungsresistenz ermi9elt, darunter PSMB3, A4GALT und POLA1. Der Abgleich unserer mRNA-Expressionsdaten mit der CGC Gensammlung ermöglichte zudem die Identifizierung von AR, STAT5B und MAP2K4, die mit der Therapieresistenz korrelieren und bekannt sind, für Ihre Bedeutung bei der Progression des Glioblastoms. Außerdem sind pharmakologische Hemmstoffe für diese Ziele verfügbar. In Bezug auf die Signalwege identifizierte die GSEA 21 positiv und 14 negative angereicherte Gensets. Dabei traten der ROS-Signalweg, der mTORC1-Signalweg und der TNFα/NF-κB-Signalweg hervor. Diese stehen in Verbindung mit der ROS-Autophagie-Ferroptose-Achse, was die Beteiligung der ROS-Autophagie-Ferroptose-Achse an der Therapieresistenz bestätigt. Mittels der LEA der Gensets konnten 14 weitere potenzielle Targets identifiziert werden, darunter G6PD, SLC7A11, PSMG1, PSMA1 und TXNRD1. Schlussfolgerung: In der vorliegenden Studie wurde eine umfassende Analyse der molekularen Faktoren, die die Therapieresistenz in menschlichen Glioblastomzellen beeinflussen, durchgeführt. Ziel war es, den Anwendungsbereich gezielter therapeutischer Strategien zu erweitern und die Effektivität und Durchführbarkeit des multi-level integrativen Ansatzes zu validieren. Der umfangreiche Datensatz, der diese Arbeit stützt, ist potenziell wertvoll für weiterführende Forschungen zur Therapieresistenz in Glioblastomzellen. Darüber hinaus kann unser systematischer Arbeitsablauf ohne weiteres auf andere Datensätze und Tumorarten angewendet werden.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 27. November 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Lauber, Kirsten