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Identifizierung und Validierung von Referenzgenen zur relativen Quantifizierung der mRNA-Expression in neonatalem murinem Lungengewebe mittels RT-qPCR
Identifizierung und Validierung von Referenzgenen zur relativen Quantifizierung der mRNA-Expression in neonatalem murinem Lungengewebe mittels RT-qPCR
Die quantitative Echtzeit-PCR (real time quantitative polymerase chain reaction, abgekürzt qPCR) ist eine moderne Technik für die Genexpressionsanalyse und ist in diversen Forschungsbereichen etabliert. Sie weist zahlreiche markante Vorteile auf, wie hohe Sensitivität und Spezifität, zuverlässige Reproduzierbarkeit sowie großer dynamischer Bereich mit der Fähigkeit, auch geringste Mengen an Genaktivität in Form von mRNA-Expression zuverlässig nachzuweisen. Für die Interpretation der gewonnenen Rohdaten wird die sog. relative Quantifizierung bevorzugt eingesetzt, weil mit dieser leicht durchführbaren Methode die experimentell bedingten, unspezifischen Variationen in der Genexpression effektiv behoben werden können und dadurch nur echte Variationen der Genexpression, die das zu untersuchende, biologische Phänomen erklärt, detektiert werden können. Bei der relativen Quantifizierung wird die Expression der Zielgene zu der der Referenzgene "relativ" quantifiziert. Um zuverlässig als Referenzgene zu dienen, muss eine vernachlässigbar niedrige Expressionsvariabilität der Referenzgene vorausgesetzt werden, und zwar idealerweise unabhängig von biologischen, technischen und experimentellen Bedingungen. Bei humanen Lungenerkrankungen werden oft Signalwege der Embryonalentwicklung reaktiviert. Daher bietet sich ein neonatales Mausmodell zur Untersuchung dieser Signalwege in murinem Lungengewebe an. Dabei ist die Auswahl geeigneter Referenzgene besonders herausfordernd, weil während des Reifungsprozesses der Lunge komplexe transkriptionelle und epigenetische Regulation diverser Gene stattfindet. Trotzdem liegen bisher nur begrenzt Daten über zuverlässige Referenzgene für Mauslungen während der neonatalen Entwicklungsphase und bei experimentell induzierter Lungenschädigung (z.B. durch Hyperoxie-Exposition) vor. Im vorliegenden Projekt haben wir konventionell verwendete Referenzgene sowie neue Referenzgenkandidaten hinsichtlich ihrer Expressionsvariabilität in neonatalen Lungen von C57BL/6-Mäuse evaluiert, wobei biologische, technische und experimentelle Effekte berücksichtigt wurden. Im ersten Schritt wurden dafür Referenzgenkandidaten aus Fachartikeln zu Mauslungenstudien bzw. zu Evaluierungsstudien, die die Zuverlässigkeit von Referenzgenen untersucht haben, zusammengetragen. Außerdem wurden mittels der Analysesoftware Genevestigator bereits publizierte Microarray-Daten auf mögliche Referenzgenkandidaten hin analysiert. Daraus ergaben sich insgesamt 122 Referenzgenkandidaten. Davon wurde anschließend eine Reihe von Genen ausgeschlossen, die einerseits unsere vordefinierten Kriterien nicht erfüllten oder andererseits eine hohe Expressionsvariabilität in unseren eigenen Microarray-Daten bzw. in Genevestigator aufwiesen. Aus dieser Vorauswahl ergaben sich 24 Referenzgenkandidaten, die in RT-qPCR-Experimenten in Lungenproben von C57BL/6-Mäusen validiert wurden. Dabei wurden biologische (Entwicklungsstadium, Geschlecht), technische 6 (RNA-Qualität) sowie experimentelle (Hyperoxie-Exposition) Variablen berücksichtigt. Die gewonnenen Expressionsdaten, repräsentiert als unbearbeitete Cq-Werte, wurden mit Hilfe von zwei gängigen Analysealgorithmen (GeNorm und Normfinder) zur Identifizierung zuverlässiger Referenzgene analysiert. Die Expression der Referenzgenkandidaten in diversen pulmonalen Zelltypen wurde in Zusammenarbeit mit unserem Projektpartner Prof. Sucre (Vanderbilt University Medical Center, Nashville, USA) mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung bestimmt. Kein einziger Referenzgenkandidat zeigte stabile Expression bei allen untersuchten Exprimentalbedingungen, so dass kein einzelnes Gen als ubiquitär verwendbares und damit ideales Referenzgen eingesetzt werden könnte. Vielmehr erwiesen sich unterschiedliche Referenzgenkandidaten abhängig von den untersuchten biologischen, technischen und experimentellen Bedingungen und vom jeweiligen Algorithmus als am stabilsten exprimiert (siehe Abb. 5-1 Zusammenfassung der zuverlässigen Referenzgene in der Diskussion). Die im Rahmen des vorliegenden Projektes identifizierten, stabil exprimierten Referenzgene werden zur akkuraten Interpretation zukünftiger RT-qPCR-Experimente in neonatalen Mäusen beitragen., RT-qPCR is the established, state-of-the-art method for gene expression analysis in a variety of research areas. The technology has distinct advantages such as high sensitivity and specificity, reliable reproducibility and high dynamic range so as to detect transcripts at low copy numbers. A so-called relative quantification is preferably applied for the interpretation of raw RT-qPCR data because the experiment-derived, unspecific variations of gene expression can be effectively removed through this easily applicable analysis method and the true variations of gene expression underlying the biologic phenomenon under investigation can be fully revealed. In the relative quantification, the expression of the gene of interest is "relatively" quantified to that of so-called reference genes. For a reliable performance, the reference genes need to possess negligible expression variability which should not be influenced by biological, technical and experimental conditions. In human pulmonary diseases, the signal pathways of embryonic development are often activated and thus, the neonatal murine model provides various possibilities for investigating these signal pathways underlying human diseases. In the developing lungs of mice, the selection of appropriate reference genes is particularly challenging since complex transcriptional and epigenetic regulations of diverse genes occur. Despite the plethora of studies with neonatal lungs, there is only limited data available addressing reference gene expression for the developing lungs with experimentally induced lung injury, e.g., by hyperoxia exposure. 7 In the present study, commonly used and novel software-predicted reference gene candidates were evaluated for their expression variability in the lung of neonatal C57BL/6 mice while considering the effect of biologic, technical and experimental variables. In a first step, published studies for commonly used reference genes or evaluation studies for reliable reference genes were reviewd. In addition, publicly available microarray datasets were screened using the Genevestigator software, resulting in an initial selection of 122 candidates. A series of candidate genes was then excluded from further processing, if they were not matching pre-defined criteria or showed high expression variability in own microarray data derived from neonatal lung and data from Genevestigator. The 24 final reference gene candidates from this pre-selection step were evaluated by RT-qPCR in lung tissue samples of C57BL/6 mice under consideration of critical biological variables (developmental stage, sex) and technical conditions (RNA quality) as well as an experimental challenge (hyperoxia exposure). The obtained expression data were analyzed using GeNorm and Normfinder algorithms to identify reliable reference genes from the candidate gene set. In cooperation with Dr. Sucre (Vanderbilt University Medical Center, Nashville, USA), the cell-specific expression of the final reference gene candidates was analyzed using single- cell RNA-sequencing in the developing mouse lung. None of the reference gene candidates showed stable gene expression throughout all investigated experimental conditions so that there was no ubiquitous ideal reference gene from our candidate genes, but rather, several different reference gene candidates were shown to be reliable reference genes depending on the investigated, biological, technical and exprimental conditions and each analysis algorithm (see Abb. 5-1 summarized reliable reference genes in the discussion section). The identified reliable reference genes will provide valuable resource for accurate interpretation of future RT-qPCR experiments investigating neonatal mouse lung tissue.
RT-qPCR, neonatal murine lung, reference gene, neonatal lung disease
Shin, Hyunkyu
2023
German
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Shin, Hyunkyu (2023): Identifizierung und Validierung von Referenzgenen zur relativen Quantifizierung der mRNA-Expression in neonatalem murinem Lungengewebe mittels RT-qPCR. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
[thumbnail of Shin_Hyunkyu.pdf] Licence: Creative Commons: Attribution 4.0 (CC-BY)
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Abstract

Die quantitative Echtzeit-PCR (real time quantitative polymerase chain reaction, abgekürzt qPCR) ist eine moderne Technik für die Genexpressionsanalyse und ist in diversen Forschungsbereichen etabliert. Sie weist zahlreiche markante Vorteile auf, wie hohe Sensitivität und Spezifität, zuverlässige Reproduzierbarkeit sowie großer dynamischer Bereich mit der Fähigkeit, auch geringste Mengen an Genaktivität in Form von mRNA-Expression zuverlässig nachzuweisen. Für die Interpretation der gewonnenen Rohdaten wird die sog. relative Quantifizierung bevorzugt eingesetzt, weil mit dieser leicht durchführbaren Methode die experimentell bedingten, unspezifischen Variationen in der Genexpression effektiv behoben werden können und dadurch nur echte Variationen der Genexpression, die das zu untersuchende, biologische Phänomen erklärt, detektiert werden können. Bei der relativen Quantifizierung wird die Expression der Zielgene zu der der Referenzgene "relativ" quantifiziert. Um zuverlässig als Referenzgene zu dienen, muss eine vernachlässigbar niedrige Expressionsvariabilität der Referenzgene vorausgesetzt werden, und zwar idealerweise unabhängig von biologischen, technischen und experimentellen Bedingungen. Bei humanen Lungenerkrankungen werden oft Signalwege der Embryonalentwicklung reaktiviert. Daher bietet sich ein neonatales Mausmodell zur Untersuchung dieser Signalwege in murinem Lungengewebe an. Dabei ist die Auswahl geeigneter Referenzgene besonders herausfordernd, weil während des Reifungsprozesses der Lunge komplexe transkriptionelle und epigenetische Regulation diverser Gene stattfindet. Trotzdem liegen bisher nur begrenzt Daten über zuverlässige Referenzgene für Mauslungen während der neonatalen Entwicklungsphase und bei experimentell induzierter Lungenschädigung (z.B. durch Hyperoxie-Exposition) vor. Im vorliegenden Projekt haben wir konventionell verwendete Referenzgene sowie neue Referenzgenkandidaten hinsichtlich ihrer Expressionsvariabilität in neonatalen Lungen von C57BL/6-Mäuse evaluiert, wobei biologische, technische und experimentelle Effekte berücksichtigt wurden. Im ersten Schritt wurden dafür Referenzgenkandidaten aus Fachartikeln zu Mauslungenstudien bzw. zu Evaluierungsstudien, die die Zuverlässigkeit von Referenzgenen untersucht haben, zusammengetragen. Außerdem wurden mittels der Analysesoftware Genevestigator bereits publizierte Microarray-Daten auf mögliche Referenzgenkandidaten hin analysiert. Daraus ergaben sich insgesamt 122 Referenzgenkandidaten. Davon wurde anschließend eine Reihe von Genen ausgeschlossen, die einerseits unsere vordefinierten Kriterien nicht erfüllten oder andererseits eine hohe Expressionsvariabilität in unseren eigenen Microarray-Daten bzw. in Genevestigator aufwiesen. Aus dieser Vorauswahl ergaben sich 24 Referenzgenkandidaten, die in RT-qPCR-Experimenten in Lungenproben von C57BL/6-Mäusen validiert wurden. Dabei wurden biologische (Entwicklungsstadium, Geschlecht), technische 6 (RNA-Qualität) sowie experimentelle (Hyperoxie-Exposition) Variablen berücksichtigt. Die gewonnenen Expressionsdaten, repräsentiert als unbearbeitete Cq-Werte, wurden mit Hilfe von zwei gängigen Analysealgorithmen (GeNorm und Normfinder) zur Identifizierung zuverlässiger Referenzgene analysiert. Die Expression der Referenzgenkandidaten in diversen pulmonalen Zelltypen wurde in Zusammenarbeit mit unserem Projektpartner Prof. Sucre (Vanderbilt University Medical Center, Nashville, USA) mittels Einzelzell-RNA-Sequenzierung bestimmt. Kein einziger Referenzgenkandidat zeigte stabile Expression bei allen untersuchten Exprimentalbedingungen, so dass kein einzelnes Gen als ubiquitär verwendbares und damit ideales Referenzgen eingesetzt werden könnte. Vielmehr erwiesen sich unterschiedliche Referenzgenkandidaten abhängig von den untersuchten biologischen, technischen und experimentellen Bedingungen und vom jeweiligen Algorithmus als am stabilsten exprimiert (siehe Abb. 5-1 Zusammenfassung der zuverlässigen Referenzgene in der Diskussion). Die im Rahmen des vorliegenden Projektes identifizierten, stabil exprimierten Referenzgene werden zur akkuraten Interpretation zukünftiger RT-qPCR-Experimente in neonatalen Mäusen beitragen.

Abstract

RT-qPCR is the established, state-of-the-art method for gene expression analysis in a variety of research areas. The technology has distinct advantages such as high sensitivity and specificity, reliable reproducibility and high dynamic range so as to detect transcripts at low copy numbers. A so-called relative quantification is preferably applied for the interpretation of raw RT-qPCR data because the experiment-derived, unspecific variations of gene expression can be effectively removed through this easily applicable analysis method and the true variations of gene expression underlying the biologic phenomenon under investigation can be fully revealed. In the relative quantification, the expression of the gene of interest is "relatively" quantified to that of so-called reference genes. For a reliable performance, the reference genes need to possess negligible expression variability which should not be influenced by biological, technical and experimental conditions. In human pulmonary diseases, the signal pathways of embryonic development are often activated and thus, the neonatal murine model provides various possibilities for investigating these signal pathways underlying human diseases. In the developing lungs of mice, the selection of appropriate reference genes is particularly challenging since complex transcriptional and epigenetic regulations of diverse genes occur. Despite the plethora of studies with neonatal lungs, there is only limited data available addressing reference gene expression for the developing lungs with experimentally induced lung injury, e.g., by hyperoxia exposure. 7 In the present study, commonly used and novel software-predicted reference gene candidates were evaluated for their expression variability in the lung of neonatal C57BL/6 mice while considering the effect of biologic, technical and experimental variables. In a first step, published studies for commonly used reference genes or evaluation studies for reliable reference genes were reviewd. In addition, publicly available microarray datasets were screened using the Genevestigator software, resulting in an initial selection of 122 candidates. A series of candidate genes was then excluded from further processing, if they were not matching pre-defined criteria or showed high expression variability in own microarray data derived from neonatal lung and data from Genevestigator. The 24 final reference gene candidates from this pre-selection step were evaluated by RT-qPCR in lung tissue samples of C57BL/6 mice under consideration of critical biological variables (developmental stage, sex) and technical conditions (RNA quality) as well as an experimental challenge (hyperoxia exposure). The obtained expression data were analyzed using GeNorm and Normfinder algorithms to identify reliable reference genes from the candidate gene set. In cooperation with Dr. Sucre (Vanderbilt University Medical Center, Nashville, USA), the cell-specific expression of the final reference gene candidates was analyzed using single- cell RNA-sequencing in the developing mouse lung. None of the reference gene candidates showed stable gene expression throughout all investigated experimental conditions so that there was no ubiquitous ideal reference gene from our candidate genes, but rather, several different reference gene candidates were shown to be reliable reference genes depending on the investigated, biological, technical and exprimental conditions and each analysis algorithm (see Abb. 5-1 summarized reliable reference genes in the discussion section). The identified reliable reference genes will provide valuable resource for accurate interpretation of future RT-qPCR experiments investigating neonatal mouse lung tissue.