Analysis of chromatin accessibility to characterize transcription factor activities in malignancies

Domínguez Moreno, Helena (2022): Analysis of chromatin accessibility to characterize transcription factor activities in malignancies. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

In the context of the study of human disorders, exploring the chromatin accessibility applying the Assay for Transposase Accessible Chromatin followed by sequencing (ATAC-seq) in combination with the study of certain histone markers via chromatin-immunoprecipita-tion followed by sequencing (ChIP-seq) has proven to be a robust approach. It allows to unravel essential transcriptional regulatory circuitry, as well as to identify genes or genetic pathways, not necessarily presenting mutations, but relevant for any aspect of the disorder, from disease progression to relapse, or even the appearance of therapy resistance. In the course of this work, three different human disorders were investigated. Our main objective was the study of Acute Myeloid Leukemia (AML), for which both experiments, ATAC-seq and ChIP-seq of the acetylation of lysine 27 of histone H3 (H3K27ac - a marker for active enhancers and super-enhancers) were performed. AML is a hematopoietic malignancy characterized by a broad genetic heterogeneity and the frequent occurrence of relapses, which compromises patient survival. In collaboration with other research groups, we additionally explored on the one hand, the mechanisms involved in the emergence of human breast cancer metastasis, and on the other hand, the response of the immune system in the context of severe autoimmune diseases using a mouse model commonly employed in the investigation of human multiple sclerosis. To deeply cover all relevant aspects of the AML disease concerning our main goal, I studied AML cell lines as in vitro model, an AML patient-derived xenograft (PDX) mouse model as in vivo model and, most importantly, paired patient-derived samples at the stages of primary diagnosis and relapse. The analysis of patient samples was of great interest to capture the nature of the disorder in its whole complexity, free of the limitations intrinsic to the two aforementioned models. The epigenetic landscape in terms of chromatin accessibility and enhancers was characterized based on 18 leukemic cell lines. They exhibited, as expected, a vast heterogeneity, setting the basis for an in vitro model to work with and validate hypothesis derived from the study of human samples. To explore the effects caused by the standard therapy over time in vivo we used PDX samples. Xenografted mice were subjected to several cycles of therapy. The derived samples were processed at three different time points to analyze the development of chromatin accessibility. Our experiments showed that at the beginning of the treatment chromatin changes barely occurred but as the therapy progressed, the effects accumulated, causing chromatin to significantly open up. The exploration and analysis performed on paired patient-derived samples clearly revealed a larger similarity with regard to the epigenetic landscape for the relapse stage among all patients analyzed. Especially apoptotic-related pathways, although primarily nonexistent in diagnosis, appeared to be commonly active in relapse. Nevertheless, due to the heterogeneity characterizing this disorder, no common pathways or genes could be identified for the whole patient cohort. Notably, for a patient subgroup, we could determine a bunch of relapse-associated relevant genes, some of which have been recently documented in the literature as playing an important role in the disease progression and even in therapy resistance, thus validating our approach.

Abstract

Im Rahmen der Erforschung menschlicher Erkrankungen, die Untersuchung der Zugänglichkeit des Chromatins mittels der Assay for Transposase Accessible Chromatin gefolgt von Sequenzierung (ATAC-seq) kombiniert mit der Untersuchung bestimmte Histonmodifikationen durch Chromatin Immunoprecipitation gefolgt von Sequenzierung (ChIP-seq) hat sich als robuster Ansatz erwiesen. Diese Strategie ermöglicht sowohl wesentliche transkriptionelle Regulationsschaltkreise als auch Gene oder genetische Pfade zu identifizieren. Diese weisen nicht unbedingt Mutationen auf, sind aber für manche Aspekte der Erkrankung relevant: von der Krankheitsprogression bis zum Rezidiv oder sogar dem Auftreten von Therapieresistenz. In dieser Arbeit wurden drei verschiedene Erkrankungen untersucht. Unser Hauptziel war dabei die Untersuchung der menschlichen Akuten Myeloischen Leukämie (AML) und dafür führte ich sowohl ATAC-seq als auch ChIP-seq für Acetylierung des Lysins 27 am Histon H3 (H3K27ac - ein Marker für aktive Enhancers und Super-enhancers) durch. AML ist eine hämatopoetische Malignität, die durch eine breite genetische Heterogenität und das häufige Auftreten von Rezidiven gekennzeichnet ist, wodurch das Überleben der Patienten beeinträchtigt wird. In Zusammenarbeit mit anderen Forschungsgruppen haben wir zwei zusätzliche menschliche Erkrankungen untersucht. Zum einen waren es die Mechanismen, die an der Entstehung von Brustkrebsmetastasen beteiligt sind. Zum anderen, die Reaktion des Immunsystems im Kontext schwerer Autoimmunerkrankungen. Dafür wurde ein Mausmodell angewendet, das häufig für die Erforschung menschlichen Multiplen Sklerose benutzt wird. Um alle relevanten Aspekte der AML umfassend abzudecken, untersuchte ich drei verschiedene Modelle: erstens, AML-Zelllinien als in-vitro-Modell; zweitens, ein von AML-Patienten abgeleitetes Xenograft (PDX)-Mausmodell als in vivo-Modell; und drittens, gepaarte Patientenproben in den Stadien der Erstdiagnose und des Rezidives. Die Analyse der Patientenproben war vom großen Interesse um die Natur der Störung in ihrer ganzen Komplexität zu erfassen, frei von den Einschränkungen, die in den zuvor genannten Modellen implizit enthalten sind. Die epigenetische Landschaft bezüglich der Chromatinzugänglichkeit und der Enhancer wurden an 18 Leukemie-Zelllinien charakterisiert. Diese Zelllinien wiesen erwartungsgemäß eine große Heterogenität auf. Das bildete die Grundlage für das in vitro-Modell, mit dem Hypothesen validiert werden können, die aus der Untersuchung menschlicher Proben abgeleitet worden sind. Mithilfe von PDX-Proben wurden die Auswirkungen der Standardtherapie über die Zeit in vivo untersucht. Dafür wurden xenotransplantierte Mäuse mehreren Therapiezyklen unterzogen. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die von Mäusen abgeleiteten Proben verarbeitet, um die Entwicklung der Chromatinzugänglichkeit zu analysieren. Die Ergebnisse der Experimente haben gezeigt, dass zu Beginn der Behandlung kaum Chromatinveränderungen auftraten, sich jedoch im Verlauf der Therapie die Wirkungen akkumulierten, wodurch sich das Chromatin deutlich öffnete. Die Analyse von gepaarten Patientenproben zeigte eine deutliche Ähnlichkeit in Bezug auf die epigenetische Landschaft für das Rezidivstadium bei allen analysierten Patienten. Insbesondere schienen apoptotisch bedingte Signalwege beim Rezidiv häufig aktiv zu sein, obwohl sie in der Diagnose nicht vorhanden waren. Jedoch aufgrund der Heterogenität, die diese Erkrankung charakterisiert, konnten für die gesamte Patientenkohorte keine gemeinsamen Signalwege oder Gene bestimmt werden. Nichtsdestotrotz konnten wir für eine Patientenuntergruppe eine Reihe von rezidivassoziierten relevanten Genen identifizieren, wobei einige von denen vor kurzem in der Literatur als wichtig für die Krankheitsprogression und auch für die Therapieresistenz dokumentiert wurden. Dadurch ist unser Ansatz grundsätzlich validiert.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 22. März 2022
• 1. Bericht­erstatter:in: Schotta, Gunnar