The role of WNT ligand secretion in idiopathic pulmonary fibrosis

Martin-Medina, Aina (2020): The role of WNT ligand secretion in idiopathic pulmonary fibrosis. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a lethal interstitial lung disease of yet unknown etiology characterized by a progressive decrease of lung function and poor prognosis. The cellular hallmarks of IPF are repetitive epithelial cell injury that leads to aberrant activity of developmental pathways, such as WNT signaling pathway, and activation of myofibroblasts which secrete extracellular matrix components in excess. Extracellular vesicles (EVs) are secreted membranous particles that transport diverse signaling mediators such as proteins, nucleic acids and lipids, over long distances thus mediating intercellular communication. The Non-canonical ligand WNT-5A is upregulated in IPF, especially in lung fibroblasts from patients in comparison to donors. Recently, it was discovered that WNT ligands are secreted on EVs which can activate WNT signaling in the receptor cells. However, the role of EVs and the secretion of WNT ligands through EVs in IPF remain largely unknown. The present work hypothesizes that EV secretion is increased in IPF and the WNT-ligand WNT-5A is transported on EVs which contributes to profibrotic lung fibroblast function. In order to characterize the EV secretion profile in IPF and elucidate the contribution of EV-bound WNT-5A to the disease, EVs were isolated from bronchoalveolar lavage fluid (BALF) from experimental lung fibrosis as well as from IPF, non IPF-ILD, non-ILD and healthy volunteer samples from two independent cohorts or from primary human lung fibroblasts (phLFs). EVs were then characterized by transmission electron microscopy, nanoparticle tracking analysis and Western Blotting (WB). These experiments reported an upregulated EV secretion in BALF from both experimental and human lung fibrosis samples with an increase in the content of the WNT-ligand WNT-5A. In addition, WNT-5A secretion on EVs was induced in primary human lung fibroblasts (phLFs) upon fibrotic stimulation by TGF-β. For functional studies, phLFs were used for EV stimulation and analysed by metabolic activity assays, qPCR and WB upon WNT-5A loss-of-function and WNT-5A stimulation studies. The phLF-derived EVs were able to promote phLF proliferation, which was attenuated by WNT-5A silencing and antibody-mediated WNT-5A inhibition. Similarly, EVs from IPF-BALF were capable of inducing phLF proliferation which was dependent on the EV-bound WNT-5A ligand. Taken together, this thesis showed that increased secretion of EVs in the IPF lung mediates WNT-5A signaling, which contributes to disease pathogenesis by increasing lung fibroblast proliferation. Future studies of EV secretion and composition, as well as their role in disease pathogenesis may lead to novel approaches for the diagnosis and treatment of pulmonary fibrosis.

Abstract

Die idiopathische Lungenfibrose (IPF) ist eine chronische interstitielle Lungenerkrankung mit bisher unbekannter Ätiologie, die durch eine fortschreitende Abnahme der Atemkapazität und einer sehr schlechten Prognose gekennzeichnet ist. Kennzeichenend fuer die IPF ist die wiederholt auftretende epitheliale Zellschädigung, die zu aberranten Aktivität von Entwicklungssignalwegen wie dem WNT-Signalweg und der Aktivierung von Myofibroblasten führen, die infolgedessen vermehrt extrazelluläre Matrixkomponenten sekretieren. Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind sekretierte Vesikel, die verschiedene Signalmoleküle wie Proteine, Nukleinsäuren und Lipide über weite Strecken transportieren und so die interzelluläre Kommunikation fördern. Es wurde festgestellt, dass der nicht-kanonische WNT-5A-Ligand in der IPF hochreguliert ist, insbesondere bei Lungenfibroblasten von IPF Patienten im Vergleich zu gesunden Spendern. Vor Kurzem wurde entdeckt, dass WNT-Liganden durch EVs transportiert werden und in der Lage sind, die WNT-Signalübertragung in den Rezeptorzellen zu aktivieren. Die Rolle von EVs und die Sekretion von WNT-Liganden in EVs ist in der IPF jedoch unbekannt. Die vorliegende Arbeit basiert auf der Hypothese, dass die EV-Sekretion in IPF erhöht ist und dass WNT-5A vermehrt in EVs sekretiert wird was zu einem profibrotischen Phänotyp der Lungenfibroblasten beiträgt. Um das EV-Sekretionsprofil in IPF zu charakterisieren und den Beitrag von EV-gebundenem WNT-5A zur Entwicklung und Fortschreiten der Krankheit aufzuklären, wurden EVs aus bronchoalveolarer Lavageflüssigkeit (BALF) von experimenteller Lungenfibrose sowie von IPF , nicht IPF-ILD und nicht ILD sowie Gesunden Proben aus zwei unterschiedlichen Kohorten, isoliert. Die EVs wurden dann durch Transmissionselektronenmikroskopie, Nanopartikel-Tracking-Analyse und Western Blot (WB) charakterisiert. Primäre humane Lungenfibroblasten (phLFs) wurden zur EV-Isolierung verwendet und durch Stoffwechselaktivitätstests, qPCR und WB nach WNT-5A-Funktionsverlust- und WNT-5A-Stimulationsstudien analysiert. Diese Experimente zeigen eine hochregulierte EV-Sekretion in BALF von sowohl experimenteller als auch humaner Lungenfibrose mit einem Anstieg des WNT-Liganden WNT-5A-. Zusätzlich wurde die WNT-5A-Sekretion auf EVs in primären menschlichen Lungenfibroblasten (phLFs) nach fibrotischer Stimulation durch TGF-β induziert. Darüber hinaus konnten die von phLF sekretierten EVs die Proliferation von phLF fördern, die durch WNT-5A-Inhibierung durch siRNA oder Antikörper Behandlung abgeschwächt wurde. In ähnlicher Weise waren EVs aus IPF-BALF in der Lage, eine PhLF-Proliferation zu induzieren, die vom EV-gebundenen WNT-5A-Liganden abhängig war. In dieser Doktorarbeit konnte gezeiget werden, dass eine erhöhte Sekretion von EVs im BALF von IPF-Erkrankten die Signalübertragung von WNT-5A vermittelt, die durch Erhöhung der Proliferation von Lungenfibroblasten zur Pathogenese der Erkrankung beiträgt. Zukünftige Studien zur Sekretion und Zusammensetzung von Evs, sowie deren Rolle bei der Pathogenese der IPF, könnten zu neuen Ansätzen für die Diagnose und Behandlung von Lungenfibrose führen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: IPF, WNT-5A, Exosomes, lung fibroblasts
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 8. Dezember 2020
• 1. Bericht­erstatter:in: Königshoff, Melanie