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EGF/EGFR-mediated Epithelial-to-Mesenchymal transition in the disease progression of head and neck squamous cell carcinoma
EGF/EGFR-mediated Epithelial-to-Mesenchymal transition in the disease progression of head and neck squamous cell carcinoma
Bei Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches (HNSCCs) wurde die Tumorheterogenität als eine Hauptursache für das Fortschreiten der Krankheit beschrieben. Der Epithelial-zu-Mesenchymal-Übergang (EMT) wurde als eine prominente Ursache der molekularen und zelluläre Heterogenität in Tumoren identifizert. Bei humanem Papillomavirus (HPV) negativen HNSCC Patienten gibt es gegenwärtig keine klinisch akzeptierten molekularbiologischen Prognostikatoren, die in die Therapieentscheidung mit einbezogen werden. Der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) wird bei HNSCC- Patienten häufig überexprimiert und ist Zielmolekül für eine adjuvante Behandlung. In früheren Arbeiten haben wir und andere die anhaltende Aktivierung der EGF/EGFR- Achse als Induktor der EMT durch die zytoplasmatischen Kinasen ERK1/2 beschrieben. Wir zeigten, dass die lösliche Ektodomäne von EpCAM, EpEX, in der Lage war, die EMT-Induktion zu blockieren. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Genregula- tion der EGF/EGFR-Achse mit Assoziation zum EMT zu untersuchen und den EMT-blockierenden Einfluss von EpEX auf Transkriptomebene zu definieren. In der vorliegenden Arbeit wurden RNA-Sequenzierungsdaten von EGF-behandelten Krebszelllinien generiert, analysiert, und die anhaltende Aktivierung der EGF/EGFR-Achse als Induktor von EMT bestätigt. Weiterhin wurde eine EGFR-vermittelte EMT Gensignatur von n = 172 hoch- und runter-regulierten EMT-Genen aus den Transkriptomdaten bioinformatisch extrahiert. Mit Hilfe einer forward-feature-selection Methode konnten fünf überlebensassoziierte Gene bei HPV-negativen HNSCC-Patienten der publizierten The Cancer Genome Atlas (TCGA, n = 240) Kohorte aus der EGFR-vermittelten EMT Gensignatur identifiziert werden. Die Implementierung der fünf überlebensassoziierten Gene in ein multivariates Cox-Modell ermöglichte es, die Genexpression zu gewichten und so einen prognostischen EGF/EGFR-vermittelten EMT-Risiko-Score mit Assoziationen zu Lymphknoteninfektionen und zum klinischen Stadium des Tumors zu berechnen. Der prognostische Wert des EGF/EGFR-vermittelten EMT-Risiko-Scores wurde in zwei unabhängigen und publizierten HPV-negativen HNSCC-Kohorten des MD Anderson Cancer Center (MDACC, n = 97) und des Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC, n = 62) bestätigt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass EpEX auf Transkriptomebene kein Repressor der EGF-vermittelten EMT ist und im Vergleich zu EGF ähnliche, aber reduzierte Genregulationsfähigkeiten, zeigt. In einem zweiten Teilabschnitt der Promotionsarbeit wurde der Einfluss einer EMT Sonderform, der partiellen EMT (pEMT), auf die Tumorerkrankung untersucht. Vorherige Studien zeigten, dass insbesondere bei HNSCC-Patienten des basal-ähnlichen mesenchymalen Subtyps die pEMT mit inter- und intratumoraler Heterogenität assoziiert ist. Unter Verwendung einer publizierten Signatur von pEMT-Genen und der Methode Single sample scoring molecular phenotype (SING) wurde die pEMT-Genexpression im HNSCC des basal-ähnlichen und mesenchymalen Subtyps zur Berechnung eines SING Scores zur Quantifizierung der p-EMT herangezogen. Dieser neue pEMT SING-Score war in zwei unabhängigen HPV-negativen HNSCC-Kohorten (TCGA und MDACC) prognostisch, konnte Patienten auf der Grundlage des Gesamtüberlebens stratifizieren, war positiv mit der Lymphknotenmetastasierung korreliert und stark mit der Expression des kanonischen EMT-Transkriptionsfaktors (EMT-TF) SLUG korreliert. Durch exogene Überexpression von SLUG in zwei Krebszelllinien der Kopf- und Halsregion wurde ein zellulärer pEMT-Phänotyp mit erhöhtem invasivem Potential und erhöhter Strahlenresistenz induziert. Der prognostischte Wert der SLUG-Proteinexpression bei HPV-negativen Patienten wurde in einer separaten Kohorte unserer Klinik durch immunohistochemische Quantifizerung von SLUG in kryo-konservierten HNSCC Proben (n = 76) bestätigt. Eine hohe Expression von SLUG war mit einem Tumorrezidiv, einer Lokalisation an den Tumorrändern und einem schlechteren krankheitsfreien Überleben assoziiert. Die vorgestellten Untersuchungen führen zu der Schlussfolgerung, dass die EGF/EGFR- Achse einen Induktor der EMT bei HPV-negativen HNSCC-Patienten mit Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf darstellt. In vorheriger Arbeit zeigten wir, dass die EGF/EGFR-Achse die kanonischen EMT-TFs SNAIL, SLUG und ZEB1 induziert. Im zweiten Teil dieser Promotionsarbeit wurde gezeigt, dass SLUG als Mediator der pEMT fungiert und dass pEMT bei HPV-negativen HNSCCs Patienten des basal-ähnlichen mesenchymalen Subtyps mit der Schwere der Erkrankung zusammenhängt., In Head and Neck Squamous Cell Carcinomas (HNSCCs), tumor heterogeneity was de- scribed as a main driver of disease progression. Epithelial-to-Mesenchymal transition (EMT) was identified as a prominent cause of molecular and cellular heterogeneity in tumors. At present, in Human papillomavirus (HPV) negative HNSCC patients, no clinically accepted molecular prognosticator is available that is implemented into treatment decision making. Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is frequently overexpressed in HNSCC patients and a target for adjuvant treatment. In previous work, we and others described sustained EGF/EGFR-signaling as an inducer of EMT through the cytoplasmic kinases ERK1/2. We showed that the soluble ectodomain of EpCAM, EpEX, was capable of blocking EMT induction. The aim of the presented thesis was the investigation of the EMT-associated gene regulation by the EGF/EGFR-axis and the identification of the EMT-impairing influence of EpEX at the transcriptome level. In the present thesis, next-generation RNA sequencing data of EGF-treated cancer cell lines was generated, analyzed, and sustained EGF/EGFR-signaling was confirmed as an inducer of EMT. Further, an EGF/EGFR-mediated EMT signature of n = 172 up- and down-regulated EMT genes was extracted from the transcriptome data through bioinformatic analysis. Using a forward feature selection method, fie survival-associated genes in HPV-negative HNSCC patients could be identified from the EGF/EGFR-mediated EMT signature in the published The Cancer Genome Atlas (TCGA, n = 240) cohort. Implementing the five survival-associated genes into a multivariate Cox model allowed to weigh the gene expression and to compute a prognostic EGF/EGFR-mediated EMT Risk Score with associations to lymph node infection and tumor clinical stage. The prognostic value of the EGF/EGFR-mediated EMT Risk Score was confirmed in two independent and published HPV-negative HNSCC cohorts from the MD Anderson Cancer Center (MDACC, n = 97) and the Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC, n = 62). Further, at the transcriptome level, EpEX is not a repressor of EGF-mediated EMT and shows similar, but reduced, gene regulation capabilities compared to EGF. In a second part of this thesis, the influence of a particular form of EMT, so called partial EMT (pEMT), on tumor progression was investigated. For HNSCC patients of the basal-like mesenchymal subtype, pEMT was shown to be associated with inter- and intratumoral heterogeneity by others. Using a published signature of common pEMT genes and the method Single sample scoring molecular phenotype (SING), pEMT gene expression in HNSCC of the basal-like and mesenchymal subtype was incorporated to compute a SING score to quantify pEMT. This novel pEMT SING score was prognostic in two independent HPV-negative HNSCC cohorts (TCGA and MDACC), was capable of stratifying patients based on overall survival, was positively correlated with nodal metastasis, and strongly correlated with the expression of canonical EMT transcription factor (EMT-TF) SLUG. By exogenous overexpression of SLUG in two cancer cell lines of the head and neck region, a cellular pEMT phenotype with elevated invasive potential and irradiation resistance was induced. Prognostic value of SLUG protein expression in HPV-negative patients was confirmed in a separate cohort from our clinic by immuno- histochemical quantification of SLUG in cryo-conserved HNSCC samples (n = 76). High expression of SLUG was associated with tumor recurrence, localization to tumor edges, and poorer disease-free survival. The presented investigations lead to the conclusion that EGF/EGFR-signaling represents an inducer of EMT in HPV-negative HNSCC patients that affects disease progression. EGF/EGFR-signaling was shown to induce the canonical EMT-TFs SNAIL, SLUG, and ZEB1. In the second part of the presented work, SLUG was identified as a mediator of pEMT and pEMT was related to disease severity in HPV-negative HNSCC-patients of the basal-like mesenchymal subtype.
HNSCC, SLUG, EGF/EGFR-signaling, Epithelial-to-Mesenchymal transition
Schinke, Henrik
2021
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Schinke, Henrik (2021): EGF/EGFR-mediated Epithelial-to-Mesenchymal transition in the disease progression of head and neck squamous cell carcinoma. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Bei Plattenepithelkarzinomen des Kopf-Hals-Bereiches (HNSCCs) wurde die Tumorheterogenität als eine Hauptursache für das Fortschreiten der Krankheit beschrieben. Der Epithelial-zu-Mesenchymal-Übergang (EMT) wurde als eine prominente Ursache der molekularen und zelluläre Heterogenität in Tumoren identifizert. Bei humanem Papillomavirus (HPV) negativen HNSCC Patienten gibt es gegenwärtig keine klinisch akzeptierten molekularbiologischen Prognostikatoren, die in die Therapieentscheidung mit einbezogen werden. Der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) wird bei HNSCC- Patienten häufig überexprimiert und ist Zielmolekül für eine adjuvante Behandlung. In früheren Arbeiten haben wir und andere die anhaltende Aktivierung der EGF/EGFR- Achse als Induktor der EMT durch die zytoplasmatischen Kinasen ERK1/2 beschrieben. Wir zeigten, dass die lösliche Ektodomäne von EpCAM, EpEX, in der Lage war, die EMT-Induktion zu blockieren. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war die Genregula- tion der EGF/EGFR-Achse mit Assoziation zum EMT zu untersuchen und den EMT-blockierenden Einfluss von EpEX auf Transkriptomebene zu definieren. In der vorliegenden Arbeit wurden RNA-Sequenzierungsdaten von EGF-behandelten Krebszelllinien generiert, analysiert, und die anhaltende Aktivierung der EGF/EGFR-Achse als Induktor von EMT bestätigt. Weiterhin wurde eine EGFR-vermittelte EMT Gensignatur von n = 172 hoch- und runter-regulierten EMT-Genen aus den Transkriptomdaten bioinformatisch extrahiert. Mit Hilfe einer forward-feature-selection Methode konnten fünf überlebensassoziierte Gene bei HPV-negativen HNSCC-Patienten der publizierten The Cancer Genome Atlas (TCGA, n = 240) Kohorte aus der EGFR-vermittelten EMT Gensignatur identifiziert werden. Die Implementierung der fünf überlebensassoziierten Gene in ein multivariates Cox-Modell ermöglichte es, die Genexpression zu gewichten und so einen prognostischen EGF/EGFR-vermittelten EMT-Risiko-Score mit Assoziationen zu Lymphknoteninfektionen und zum klinischen Stadium des Tumors zu berechnen. Der prognostische Wert des EGF/EGFR-vermittelten EMT-Risiko-Scores wurde in zwei unabhängigen und publizierten HPV-negativen HNSCC-Kohorten des MD Anderson Cancer Center (MDACC, n = 97) und des Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC, n = 62) bestätigt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass EpEX auf Transkriptomebene kein Repressor der EGF-vermittelten EMT ist und im Vergleich zu EGF ähnliche, aber reduzierte Genregulationsfähigkeiten, zeigt. In einem zweiten Teilabschnitt der Promotionsarbeit wurde der Einfluss einer EMT Sonderform, der partiellen EMT (pEMT), auf die Tumorerkrankung untersucht. Vorherige Studien zeigten, dass insbesondere bei HNSCC-Patienten des basal-ähnlichen mesenchymalen Subtyps die pEMT mit inter- und intratumoraler Heterogenität assoziiert ist. Unter Verwendung einer publizierten Signatur von pEMT-Genen und der Methode Single sample scoring molecular phenotype (SING) wurde die pEMT-Genexpression im HNSCC des basal-ähnlichen und mesenchymalen Subtyps zur Berechnung eines SING Scores zur Quantifizierung der p-EMT herangezogen. Dieser neue pEMT SING-Score war in zwei unabhängigen HPV-negativen HNSCC-Kohorten (TCGA und MDACC) prognostisch, konnte Patienten auf der Grundlage des Gesamtüberlebens stratifizieren, war positiv mit der Lymphknotenmetastasierung korreliert und stark mit der Expression des kanonischen EMT-Transkriptionsfaktors (EMT-TF) SLUG korreliert. Durch exogene Überexpression von SLUG in zwei Krebszelllinien der Kopf- und Halsregion wurde ein zellulärer pEMT-Phänotyp mit erhöhtem invasivem Potential und erhöhter Strahlenresistenz induziert. Der prognostischte Wert der SLUG-Proteinexpression bei HPV-negativen Patienten wurde in einer separaten Kohorte unserer Klinik durch immunohistochemische Quantifizerung von SLUG in kryo-konservierten HNSCC Proben (n = 76) bestätigt. Eine hohe Expression von SLUG war mit einem Tumorrezidiv, einer Lokalisation an den Tumorrändern und einem schlechteren krankheitsfreien Überleben assoziiert. Die vorgestellten Untersuchungen führen zu der Schlussfolgerung, dass die EGF/EGFR- Achse einen Induktor der EMT bei HPV-negativen HNSCC-Patienten mit Auswirkungen auf den Krankheitsverlauf darstellt. In vorheriger Arbeit zeigten wir, dass die EGF/EGFR-Achse die kanonischen EMT-TFs SNAIL, SLUG und ZEB1 induziert. Im zweiten Teil dieser Promotionsarbeit wurde gezeigt, dass SLUG als Mediator der pEMT fungiert und dass pEMT bei HPV-negativen HNSCCs Patienten des basal-ähnlichen mesenchymalen Subtyps mit der Schwere der Erkrankung zusammenhängt.

Abstract

In Head and Neck Squamous Cell Carcinomas (HNSCCs), tumor heterogeneity was de- scribed as a main driver of disease progression. Epithelial-to-Mesenchymal transition (EMT) was identified as a prominent cause of molecular and cellular heterogeneity in tumors. At present, in Human papillomavirus (HPV) negative HNSCC patients, no clinically accepted molecular prognosticator is available that is implemented into treatment decision making. Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) is frequently overexpressed in HNSCC patients and a target for adjuvant treatment. In previous work, we and others described sustained EGF/EGFR-signaling as an inducer of EMT through the cytoplasmic kinases ERK1/2. We showed that the soluble ectodomain of EpCAM, EpEX, was capable of blocking EMT induction. The aim of the presented thesis was the investigation of the EMT-associated gene regulation by the EGF/EGFR-axis and the identification of the EMT-impairing influence of EpEX at the transcriptome level. In the present thesis, next-generation RNA sequencing data of EGF-treated cancer cell lines was generated, analyzed, and sustained EGF/EGFR-signaling was confirmed as an inducer of EMT. Further, an EGF/EGFR-mediated EMT signature of n = 172 up- and down-regulated EMT genes was extracted from the transcriptome data through bioinformatic analysis. Using a forward feature selection method, fie survival-associated genes in HPV-negative HNSCC patients could be identified from the EGF/EGFR-mediated EMT signature in the published The Cancer Genome Atlas (TCGA, n = 240) cohort. Implementing the five survival-associated genes into a multivariate Cox model allowed to weigh the gene expression and to compute a prognostic EGF/EGFR-mediated EMT Risk Score with associations to lymph node infection and tumor clinical stage. The prognostic value of the EGF/EGFR-mediated EMT Risk Score was confirmed in two independent and published HPV-negative HNSCC cohorts from the MD Anderson Cancer Center (MDACC, n = 97) and the Fred Hutchinson Cancer Research Center (FHCRC, n = 62). Further, at the transcriptome level, EpEX is not a repressor of EGF-mediated EMT and shows similar, but reduced, gene regulation capabilities compared to EGF. In a second part of this thesis, the influence of a particular form of EMT, so called partial EMT (pEMT), on tumor progression was investigated. For HNSCC patients of the basal-like mesenchymal subtype, pEMT was shown to be associated with inter- and intratumoral heterogeneity by others. Using a published signature of common pEMT genes and the method Single sample scoring molecular phenotype (SING), pEMT gene expression in HNSCC of the basal-like and mesenchymal subtype was incorporated to compute a SING score to quantify pEMT. This novel pEMT SING score was prognostic in two independent HPV-negative HNSCC cohorts (TCGA and MDACC), was capable of stratifying patients based on overall survival, was positively correlated with nodal metastasis, and strongly correlated with the expression of canonical EMT transcription factor (EMT-TF) SLUG. By exogenous overexpression of SLUG in two cancer cell lines of the head and neck region, a cellular pEMT phenotype with elevated invasive potential and irradiation resistance was induced. Prognostic value of SLUG protein expression in HPV-negative patients was confirmed in a separate cohort from our clinic by immuno- histochemical quantification of SLUG in cryo-conserved HNSCC samples (n = 76). High expression of SLUG was associated with tumor recurrence, localization to tumor edges, and poorer disease-free survival. The presented investigations lead to the conclusion that EGF/EGFR-signaling represents an inducer of EMT in HPV-negative HNSCC patients that affects disease progression. EGF/EGFR-signaling was shown to induce the canonical EMT-TFs SNAIL, SLUG, and ZEB1. In the second part of the presented work, SLUG was identified as a mediator of pEMT and pEMT was related to disease severity in HPV-negative HNSCC-patients of the basal-like mesenchymal subtype.