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Contractile cell plasticity in inherited cerebral small vessel disease
Contractile cell plasticity in inherited cerebral small vessel disease
Cerebral small vessel disease (SVD) is a major cause of stroke and disability. This is especially true for hereditary forms featuring more severe phenotypes. CARASIL is an early onset familial SVD caused by homozygous mutations in the gene encoding the protease HTRA1. In addition, heterozygous HTRA1 mutations have recently been shown to cause milder SVD. HTRA1 plays a crucial role in transforming growth factor-beta (TGF-beta) signaling, which, in turn, regulates cell differentiation, including that of vascular smooth muscle cells. However, the molecular and cellular mechanisms that promote HTRA1-related SVD are largely unknown. In the present study, I used skin fibroblasts from patients bearing homo- or heterozygous HTRA1 mutations and performed mRNA and protein analysis, as well as contraction assays. I evidenced that HTRA1 loss-of-function correlates with decreased TGF-beta signaling activity in heterozygous cells. Moreover, I established that heterozygous patient cells display a downregulation of contractile proteins, a reduced contractile activity and an upregulation of phagocytosis-associated markers, suggesting a disease-related cell phenotype switch from contractile to phagocytic. Accordingly, immunoblot and in situ immunohistochemistry both confirmed a reduced contractile marker expression in cerebral vessels of HTRA1-/- mice. I identfied the transcriptional regulator Klf4 as a putative orchestrator of disease-related cell phenotypic switching and demonstrated that treatment with recombinant TGF-beta is sufficient to restore TGF-beta signaling and contractile cell function ex vivo. Together, my data provide new insights in the pathomechanisms underlying HTRA1-related SVD., Zerebrale Mikroangiopathien sind bedeutende Ursachen von Schlaganfällen und anderer krankheitsbedingter Lebensqualitätseinbußen. Dies gilt besonders für vererbte Formen, welche überwiegend durch stärker ausgeprägte Krankheitssymptome auffallen. CARASIL ist eine hereditäre zerebrale Mikroangiopathie mit früher Erstmanifestation und wird durch homozygote Mutationen in dem für die Protease HTRA1 codierenden Gen hervorgerufen. In jüngerer Vergangenheit wurden zudem heterozygote Mutationen in HTRA1 als Ursache von zerebralen Mikroangiopathien schwächeren Phänotyps identifiziert. HTRA1 ist ein wichtiger Bestandteil des TGF-beta-Signalweges, der die Differenzierung verschiedener Zelltypen einschließlich glatter Gefäßmuskelzellen reguliert. Die molekularen und zellulären Mechanismen, welche an der Manifestation HTRA1-assoziierter zerebraler Mikroangiopathien beteiligt sind, sind weitestgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit führte ich an kultivierten Fibroblasten von Patienten mit homo- bzw. heterozygoten HTRA1-Mutationen mRNA- und Proteinanalysen sowie Kontraktionsassays durch. Ich konnte zeigen, dass ein Funktionsverlust von HTRA1 mit einer verminderten TGF-beta-Signalaktivität in heterozygoten Zellen einhergeht. Zudem beobachtete ich in diesen Zellen einen Verlust kontraktiler Marker, eine herabgesetzte Kontraktilität, sowie eine vermehrte Expression phagozytoseassoziierter Marker. In der Zusammenschau legen meine Beobachtungen somit eine krankhafte Umdifferenzierung von einem kontraktilen hin zu einem phagozytischen Zellphänotyp nahe. Analog hierzu konnte ich mittels Western Blot und in situ-Immunhistochemie eine reduzierte Expression kontraktiler Marker in zerebralen Blutgefäßen HTRA1-defizienter Mäuse nachweisen. Des Weiteren identifizierte ich den Transkriptionsfaktor Klf4 als mögliches Regulationselement besagter krankhaften Veränderung des Zellphänotyps und zeigte, dass mittels Behandlung mit rekombinantem TGF-beta eine suffiziente Wiederherstellung der TGF-beta-Signalkaskade sowie der kontraktilen Zellfunktion ex vivo erreicht werden kann. Zusammenfassend gesagt zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit neue Erkenntnisse über die Pathomechanismen, welche der HTRA1-assoziierten zerebralen Mikroangiopathie zugrunde liegen, auf.
carasil, small vessel disease, stroke, dementia, smooth muscle cells, phenotypic switching
Landinger, Timon
2021
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Landinger, Timon (2021): Contractile cell plasticity in inherited cerebral small vessel disease. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Cerebral small vessel disease (SVD) is a major cause of stroke and disability. This is especially true for hereditary forms featuring more severe phenotypes. CARASIL is an early onset familial SVD caused by homozygous mutations in the gene encoding the protease HTRA1. In addition, heterozygous HTRA1 mutations have recently been shown to cause milder SVD. HTRA1 plays a crucial role in transforming growth factor-beta (TGF-beta) signaling, which, in turn, regulates cell differentiation, including that of vascular smooth muscle cells. However, the molecular and cellular mechanisms that promote HTRA1-related SVD are largely unknown. In the present study, I used skin fibroblasts from patients bearing homo- or heterozygous HTRA1 mutations and performed mRNA and protein analysis, as well as contraction assays. I evidenced that HTRA1 loss-of-function correlates with decreased TGF-beta signaling activity in heterozygous cells. Moreover, I established that heterozygous patient cells display a downregulation of contractile proteins, a reduced contractile activity and an upregulation of phagocytosis-associated markers, suggesting a disease-related cell phenotype switch from contractile to phagocytic. Accordingly, immunoblot and in situ immunohistochemistry both confirmed a reduced contractile marker expression in cerebral vessels of HTRA1-/- mice. I identfied the transcriptional regulator Klf4 as a putative orchestrator of disease-related cell phenotypic switching and demonstrated that treatment with recombinant TGF-beta is sufficient to restore TGF-beta signaling and contractile cell function ex vivo. Together, my data provide new insights in the pathomechanisms underlying HTRA1-related SVD.

Abstract

Zerebrale Mikroangiopathien sind bedeutende Ursachen von Schlaganfällen und anderer krankheitsbedingter Lebensqualitätseinbußen. Dies gilt besonders für vererbte Formen, welche überwiegend durch stärker ausgeprägte Krankheitssymptome auffallen. CARASIL ist eine hereditäre zerebrale Mikroangiopathie mit früher Erstmanifestation und wird durch homozygote Mutationen in dem für die Protease HTRA1 codierenden Gen hervorgerufen. In jüngerer Vergangenheit wurden zudem heterozygote Mutationen in HTRA1 als Ursache von zerebralen Mikroangiopathien schwächeren Phänotyps identifiziert. HTRA1 ist ein wichtiger Bestandteil des TGF-beta-Signalweges, der die Differenzierung verschiedener Zelltypen einschließlich glatter Gefäßmuskelzellen reguliert. Die molekularen und zellulären Mechanismen, welche an der Manifestation HTRA1-assoziierter zerebraler Mikroangiopathien beteiligt sind, sind weitestgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit führte ich an kultivierten Fibroblasten von Patienten mit homo- bzw. heterozygoten HTRA1-Mutationen mRNA- und Proteinanalysen sowie Kontraktionsassays durch. Ich konnte zeigen, dass ein Funktionsverlust von HTRA1 mit einer verminderten TGF-beta-Signalaktivität in heterozygoten Zellen einhergeht. Zudem beobachtete ich in diesen Zellen einen Verlust kontraktiler Marker, eine herabgesetzte Kontraktilität, sowie eine vermehrte Expression phagozytoseassoziierter Marker. In der Zusammenschau legen meine Beobachtungen somit eine krankhafte Umdifferenzierung von einem kontraktilen hin zu einem phagozytischen Zellphänotyp nahe. Analog hierzu konnte ich mittels Western Blot und in situ-Immunhistochemie eine reduzierte Expression kontraktiler Marker in zerebralen Blutgefäßen HTRA1-defizienter Mäuse nachweisen. Des Weiteren identifizierte ich den Transkriptionsfaktor Klf4 als mögliches Regulationselement besagter krankhaften Veränderung des Zellphänotyps und zeigte, dass mittels Behandlung mit rekombinantem TGF-beta eine suffiziente Wiederherstellung der TGF-beta-Signalkaskade sowie der kontraktilen Zellfunktion ex vivo erreicht werden kann. Zusammenfassend gesagt zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit neue Erkenntnisse über die Pathomechanismen, welche der HTRA1-assoziierten zerebralen Mikroangiopathie zugrunde liegen, auf.