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APLN-APLNR signaling controls tumor angiogenesis and glioblastoma cell invasion
APLN-APLNR signaling controls tumor angiogenesis and glioblastoma cell invasion
Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist ein tödlicher Tumor, der 2,5 Personen von 100000 Erwachsenen pro Jahr betrifft. Trotz der aggressiven Interventionen hat ein Patient eine Lebenserwartung von 14-16 Monaten. Die GBM-Zellen dringen in das Tumorparenchym ein und breiten sich von der ursprünglichen Masse zu entfernten Stellen aus. Der wachsende Tumor induziert das Aussprossen der vorhandenen Blutgefäße und die vaskuläre Proliferation, die als das Phänomen der "Tumorangiogenese“ bekannt ist. Angesichts der ausgeprägten Vaskularisierung des Glioblastoms stellen antiangiogene Wirkstoffe eine vielversprechende therapeutische Strategie dar und viele Medikamente werden derzeit untersucht, um diese Malignität zu behandeln. Die meisten Interventionen zielen auf das Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Signal ab, aber ihre langfristigen Vorteile haben den Erwartungen nicht entsprochen: der Tumor kommt immer wieder, unterstützt von der Hochregulation anderer angiogener Signale und der zusätzlichen Hilfe der Tumor-assoziierten myeloiden Zellen. Deshalb ist die Validierung alternativer Ziele ein drängendes Thema in der präklinischen Forschung, um effizientere Therapien gegen das GBM zu finden. Unter den vielen neuen antiangiogenen Signalen, die an der GBM-Neoangiogenese beteiligt sind, hat die aktuelle Forschung neue Aufmerksamkeit auf den Apelin - Apelin Rezeptor (APLN-APLNR) Signalweg gelenkt. Das APLN-APLNR-Signal spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des vaskulären Systems während der Embriogenese, aber auch bei verschiedenen pathologischen Zuständen. In meiner Doktorarbeit habe ich eine ausführliche Charakterisierung der Expression von APLN und APLNR in in vitro Zellkulturen aus GBM-Patienten und in GBM Maus- und menschlichen Proben durchgeführt. Ligand und Rezeptor sind im GBM-Gewebe hochreguliert und diese Hochregulation ist mit dem angiogenen GBM-Phänotyp assoziiert. Die Erzeugung mehrerer primärer GBM-Zellen mit Verlust der APLN-Expression hat dabei die Notwendigkeit des APLN-Signals für die GBM-Neoangiogenese bestätigt. Außerdem, führte der Verlust eines autokrinen APLN-APLNR-Signals in den implantierten GBM-Zellen zu einer erhöhen Tumorinvasion. In verschiedenen humanen GBM-Proben wies die besondere Verteilung von Ligand und Rezeptor in der Tumormasse auf die Doppelrolle dieses Signals sowohl bei der Tumorangiogenese als auch der Tumorzell-Invasion hin. Die invasive Fähigkeit der GBM-Zellen mit APLN-Verlust wurde in vitro umfassend charakterisiert, wobei, analog zu den in vivo Resultaten, das Fehlen eines autokrinen APLN-APLNR-Signals die Zellinvasion antreibt. Zusätzlich fand ich heraus, dass die Blockade von APLNR die Zellinvasion in vitro beeinflusst und dass die intrazelluläre Rezeptorverteilung sich dabei ändert. Daher könnte der Aktivierungsstatus des Rezeptors selbst eine zentrale Funktion bei der Bestimmung des GBM-Zellverhaltens haben. Die zusätzlich hergestellten primären GBM-Zellen mit APLNR-Verlust werden in zukünftigen Studien eine bessere Charakterisierung des APLNR Rezeptors und seiner Rolle als Treiber der Tumorinvasion ermöglichen. Die Analyse verschiedener Proben von Patienten und Mausmodelle, die aus Studien über die Behandlung des GBMs mit antiangiogenen Mitteln kommen, zeigte, dass der APLN-APLNR-Signalweg auch an der Rekurrenz des Tumors beteiligt ist. Des Weiteren konnte ich darlegen, dass die therapeutische Blockade von APLNR in vivo, die die Tumorinvasion und Angiogenese reduzierte, eine erhöhte Akkumulation von intratumoralen myeloiden Zellen auslöst, welche mit der Tumorrekurrenz nach Verabreichung von antiangiogenen Behandlungen verbunden zu sein scheint. Insgesamt, zeigte es sich in meiner Arbeit, dass der APLN-APLNR-Signalweg, mit seiner prominenten Expression in GBM-Gewebe und seiner Rolle bei der Eindämmung der GBM-Invasion und –Angiogenese, ein interessantes Ziel für zukünftige Tumortherapien darstellt. Weitere Studien sind jedoch notwendig, um die Konsequenzen und das therapeutische Potenzial seiner Blockade vollständig zu offenbaren., Glioblastoma multiforme (GBM) is a deadly tumor that affects 2.5 people every 100000 adults per year. Despite the aggressive interventions, a GBM patient has a life expectancy of 14-16 months. GBM cells invade the tumor parenchyma and spread to distant sites from the original mass. The growing tumor induces sprouting of the existing vessels and vascular proliferation, the phenomenon known as “tumor angiogenesis”. Given the prominent vascularization of glioblastoma, anti-angiogenic agents are a promising strategy for the treatment of this malignancy and many drugs are under evaluation. The majority of these interventions, which target the vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway, do not show long-term benefits: tumor rebound always occurs, supported by the upregulation of other angiogenic pathways and the tumor-promoting role of the tumor-associated myeloid cells. Therefore, the validation of alternative targets for more efficient therapies is an urgent need in preclinical research. Among other emerging angiogenic pathways involved in GBM neo-angiogenesis, recent findings brought attention to the apelin-apelin receptor (APLN-APLNR) signaling, which has a primary role in the development of the vascular system during embryogenesis, but it is also associated to different pathological conditions. In the present thesis, I performed an extensive characterization of the expression of APLN and APLNR in in vitro cultures of patient-derived GBM cells and in mouse and human GBM specimens. Ligand and receptor were up-regulated in the GBM tissue and this upregulation was associated with the GBM angiogenic phenotype. The generation of several primary GBM cells with loss of APLN expression confirmed that GBM neo-angiogenesis in vivo depends on APLN function. Moreover, the loss of an autocrine APLN-APLNR signaling in the implanted GBM cells drove tumor invasion. In various human GBM samples, the peculiar distribution of both ligand and receptor across the tumor mass hinted to the dual role of the pathway in tumor angiogenesis and invasion. The invasive ability of the GBM cells with loss of APLN was extensively characterized in vitro, where, as demonstrated in vivo, the absence of an autocrine APLN-APLNR signaling increased cell invasion. In addition, the in vivo intratumoral administration of the receptor antagonist apelin-F13A was able to reduce tumor invasion and angiogenesis. In vitro, the exposure to apelin-F13A reduced the invasive abilities of the cells tested. Moreover, the administration of apelin-13 and apelin-F13A did not only modify the in vitro and in vivo behavior of the GBM cells, but also the intracellular distribution of APLNR. Therefore, the distribution/activation status of the receptor itself may have a central function in the determination of the GBM phenotype. Next, the analysis of various samples obtained from different studies of GBMs therapeutically-treated with anti-angiogenic agents, demonstrated that the APLN-APLNR signaling, aside from being a driver of tumor progression, may also be involved in therapy resistance. Overall, the prominent expression of the APLN-APLNR signaling in GBM tissue and its role in driving GBM invasion and angiogenesis indicate its promising function as target of future tumor therapies. Further studies, however, are required to fully disclose the consequences and the therapeutic potential of its blockade.
glioblastoma, angiogenesis, invasion, APLN, APLNR, anti-angiogenic therapies
Mastrella, Giorgia
2019
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Mastrella, Giorgia (2019): APLN-APLNR signaling controls tumor angiogenesis and glioblastoma cell invasion. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Das Glioblastoma multiforme (GBM) ist ein tödlicher Tumor, der 2,5 Personen von 100000 Erwachsenen pro Jahr betrifft. Trotz der aggressiven Interventionen hat ein Patient eine Lebenserwartung von 14-16 Monaten. Die GBM-Zellen dringen in das Tumorparenchym ein und breiten sich von der ursprünglichen Masse zu entfernten Stellen aus. Der wachsende Tumor induziert das Aussprossen der vorhandenen Blutgefäße und die vaskuläre Proliferation, die als das Phänomen der "Tumorangiogenese“ bekannt ist. Angesichts der ausgeprägten Vaskularisierung des Glioblastoms stellen antiangiogene Wirkstoffe eine vielversprechende therapeutische Strategie dar und viele Medikamente werden derzeit untersucht, um diese Malignität zu behandeln. Die meisten Interventionen zielen auf das Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Signal ab, aber ihre langfristigen Vorteile haben den Erwartungen nicht entsprochen: der Tumor kommt immer wieder, unterstützt von der Hochregulation anderer angiogener Signale und der zusätzlichen Hilfe der Tumor-assoziierten myeloiden Zellen. Deshalb ist die Validierung alternativer Ziele ein drängendes Thema in der präklinischen Forschung, um effizientere Therapien gegen das GBM zu finden. Unter den vielen neuen antiangiogenen Signalen, die an der GBM-Neoangiogenese beteiligt sind, hat die aktuelle Forschung neue Aufmerksamkeit auf den Apelin - Apelin Rezeptor (APLN-APLNR) Signalweg gelenkt. Das APLN-APLNR-Signal spielt eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des vaskulären Systems während der Embriogenese, aber auch bei verschiedenen pathologischen Zuständen. In meiner Doktorarbeit habe ich eine ausführliche Charakterisierung der Expression von APLN und APLNR in in vitro Zellkulturen aus GBM-Patienten und in GBM Maus- und menschlichen Proben durchgeführt. Ligand und Rezeptor sind im GBM-Gewebe hochreguliert und diese Hochregulation ist mit dem angiogenen GBM-Phänotyp assoziiert. Die Erzeugung mehrerer primärer GBM-Zellen mit Verlust der APLN-Expression hat dabei die Notwendigkeit des APLN-Signals für die GBM-Neoangiogenese bestätigt. Außerdem, führte der Verlust eines autokrinen APLN-APLNR-Signals in den implantierten GBM-Zellen zu einer erhöhen Tumorinvasion. In verschiedenen humanen GBM-Proben wies die besondere Verteilung von Ligand und Rezeptor in der Tumormasse auf die Doppelrolle dieses Signals sowohl bei der Tumorangiogenese als auch der Tumorzell-Invasion hin. Die invasive Fähigkeit der GBM-Zellen mit APLN-Verlust wurde in vitro umfassend charakterisiert, wobei, analog zu den in vivo Resultaten, das Fehlen eines autokrinen APLN-APLNR-Signals die Zellinvasion antreibt. Zusätzlich fand ich heraus, dass die Blockade von APLNR die Zellinvasion in vitro beeinflusst und dass die intrazelluläre Rezeptorverteilung sich dabei ändert. Daher könnte der Aktivierungsstatus des Rezeptors selbst eine zentrale Funktion bei der Bestimmung des GBM-Zellverhaltens haben. Die zusätzlich hergestellten primären GBM-Zellen mit APLNR-Verlust werden in zukünftigen Studien eine bessere Charakterisierung des APLNR Rezeptors und seiner Rolle als Treiber der Tumorinvasion ermöglichen. Die Analyse verschiedener Proben von Patienten und Mausmodelle, die aus Studien über die Behandlung des GBMs mit antiangiogenen Mitteln kommen, zeigte, dass der APLN-APLNR-Signalweg auch an der Rekurrenz des Tumors beteiligt ist. Des Weiteren konnte ich darlegen, dass die therapeutische Blockade von APLNR in vivo, die die Tumorinvasion und Angiogenese reduzierte, eine erhöhte Akkumulation von intratumoralen myeloiden Zellen auslöst, welche mit der Tumorrekurrenz nach Verabreichung von antiangiogenen Behandlungen verbunden zu sein scheint. Insgesamt, zeigte es sich in meiner Arbeit, dass der APLN-APLNR-Signalweg, mit seiner prominenten Expression in GBM-Gewebe und seiner Rolle bei der Eindämmung der GBM-Invasion und –Angiogenese, ein interessantes Ziel für zukünftige Tumortherapien darstellt. Weitere Studien sind jedoch notwendig, um die Konsequenzen und das therapeutische Potenzial seiner Blockade vollständig zu offenbaren.

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM) is a deadly tumor that affects 2.5 people every 100000 adults per year. Despite the aggressive interventions, a GBM patient has a life expectancy of 14-16 months. GBM cells invade the tumor parenchyma and spread to distant sites from the original mass. The growing tumor induces sprouting of the existing vessels and vascular proliferation, the phenomenon known as “tumor angiogenesis”. Given the prominent vascularization of glioblastoma, anti-angiogenic agents are a promising strategy for the treatment of this malignancy and many drugs are under evaluation. The majority of these interventions, which target the vascular endothelial growth factor (VEGF) signaling pathway, do not show long-term benefits: tumor rebound always occurs, supported by the upregulation of other angiogenic pathways and the tumor-promoting role of the tumor-associated myeloid cells. Therefore, the validation of alternative targets for more efficient therapies is an urgent need in preclinical research. Among other emerging angiogenic pathways involved in GBM neo-angiogenesis, recent findings brought attention to the apelin-apelin receptor (APLN-APLNR) signaling, which has a primary role in the development of the vascular system during embryogenesis, but it is also associated to different pathological conditions. In the present thesis, I performed an extensive characterization of the expression of APLN and APLNR in in vitro cultures of patient-derived GBM cells and in mouse and human GBM specimens. Ligand and receptor were up-regulated in the GBM tissue and this upregulation was associated with the GBM angiogenic phenotype. The generation of several primary GBM cells with loss of APLN expression confirmed that GBM neo-angiogenesis in vivo depends on APLN function. Moreover, the loss of an autocrine APLN-APLNR signaling in the implanted GBM cells drove tumor invasion. In various human GBM samples, the peculiar distribution of both ligand and receptor across the tumor mass hinted to the dual role of the pathway in tumor angiogenesis and invasion. The invasive ability of the GBM cells with loss of APLN was extensively characterized in vitro, where, as demonstrated in vivo, the absence of an autocrine APLN-APLNR signaling increased cell invasion. In addition, the in vivo intratumoral administration of the receptor antagonist apelin-F13A was able to reduce tumor invasion and angiogenesis. In vitro, the exposure to apelin-F13A reduced the invasive abilities of the cells tested. Moreover, the administration of apelin-13 and apelin-F13A did not only modify the in vitro and in vivo behavior of the GBM cells, but also the intracellular distribution of APLNR. Therefore, the distribution/activation status of the receptor itself may have a central function in the determination of the GBM phenotype. Next, the analysis of various samples obtained from different studies of GBMs therapeutically-treated with anti-angiogenic agents, demonstrated that the APLN-APLNR signaling, aside from being a driver of tumor progression, may also be involved in therapy resistance. Overall, the prominent expression of the APLN-APLNR signaling in GBM tissue and its role in driving GBM invasion and angiogenesis indicate its promising function as target of future tumor therapies. Further studies, however, are required to fully disclose the consequences and the therapeutic potential of its blockade.