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Generation and functional analysis of the ALS associated HNRNPA zebrafish mutants
Generation and functional analysis of the ALS associated HNRNPA zebrafish mutants
The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is clinically characterized by the progressive loss of upper and lower motoneurons and pathologically by the presence of Tar DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43) positive aggregates. The cause of this fatal and rapidly progressing disease, for which effective treatments are lacking, remains still unknown. Increasing evidence points to altered RNA metabolism as a potential pathomechanism due to the high percentage of RNA binding proteins (RBP) encoded by disease causing genes and their aggregation in ALS patients. Mutations in the RBPs Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A1 (HNRNPA1) and HNRNPA2B1 were identified in ALS and Multisystem proteinopathy (MSP) patients. Another member of the HNRNPA family, HNRNPA3, was also linked to ALS due to its ability to bind Chromosome 9 open reading frame 72 (C9ORF72) repeats, and its localization to p62 positive TDP-43 negative C9ORF72 inclusions. The structural similarity of HNRNPA proteins to TDP-43, their ability to bind one another, and the presence of TDP-43 aggregates in HNRNPA1 and HNRNPA2 mutation carriers, suggest common pathomechanisms of these proteins. To unravel the physiological function of HNRNPA1, HNRNA2B1, and HNRNPA3, and their association to ALS, this study aims to establish zebrafish loss of function mutants lacking the orthologues of the corresponding genes. Genetic analysis revealed that due to the teleost specific genome duplication zebrafish possess two HNRNPA1 orthologues named hnrnpa1a and hnrnpa1b, but no HNRNPA2B1 orthologue. In this thesis hnrnpa1a, hnrnpa1b, and hnrnpa3 zebrafish mutants were generated and characterized, and compared to the tardbp-/-; tardbpl-/- mutant, which lacks the zebrafish TDP-43 orthologues. While single hnrnpa1a, hnrnpa1b, and hnrnpa3 knockout (KO) zebrafish are viable and fertile, double hnrnpa1a and hnrnpa1b KO mutants are embryonically lethal. Moreover, the double mutants are developmentally delayed, have shortened motoneuron axons, muscle defects, show vascular mispatterning with reduced or absent blood flow, have a thinned yolk extension and increased neutral lipid uptake from the yolk. Some of these phenotypic alterations, such as shortened motoneurons and degenerated muscles, are also present in tardbp-/-; tardbpl-/- mutants and are presumably a general phenomena preceeding the embryonic lethality. The impaired intersomitic vessels observed in both mutants show distinct characteristics, since hnrnpa1a-/-; hnrnpa1b-/- mutants only develop dorsal lateral lamellopodia, diverting from their physiological migration path and misconnect, whereas tardbp-/-; tardbpl-/- mutants additionally have ectopic endothelial sprouts from the dorsal aorta. RNA sequencing of hnrnpa1a-/-; hnrnpa1b-/- embryos revealed apolipoprotein (apoda.1) as one of the top downregulated genes. APOD is a lipid transporter and was previously shown to be neuroprotective. Upon knockdown of apoda.1 in wildtype embryos we could mimic the lipid phenotype observed in hnrnpa1a-/-; hnrnpa1b-/- mutants. This finding points to a direct link between HNRNPA1 loss of function and downregulation of APOD. We hypothesize that HNRNPA1 ALS patients lack the neuroprotective, Die neurodegenerative Erkrankung Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist klinisch durch den Verlust der oberen und unteren Motorneuronen und pathologisch durch die Präsenz von Tar DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43) positiven Aggregaten gekennzeichnet. Die Ursache dieser unheilbaren und schnell fortschreitenden Krankheit ist bisher nicht bekannt. Mehrere Forschungsergebnisse, wie zum Beispiel der große Anteil an aggregierenden RNA bindenden Proteinen (RBPs) und Mutationen in den entsprechenden Genen als Krankheitsursache in ALS Patienten, deuten darauf hin, dass veränderter RNA Metabolismus eine große Rolle in der Krankheitspathogenese spielt. Mutationen in den RBPs Heterogeneous nuklear ribonukleoprotein A1 (HNRNPA1) und HNRNPA2B1 wurden in Multisystem Proteinopathy (MSP) und ALS Patienten identifiziert. Ein weiteres Mitglied der HNRNPA Protein Familie, HNRNPA3, wurde zudem mit ALS assoziiert, da es an Chromosome 9 open reading frame 72 (C9ORF72) Wiederholungssequenzen bindet und mit p62 positiven TDP-43 negativen C9ORF72 Aggregaten kolokalisiert. Die strukturelle Ähnlichkeit der HNRNPA Proteine zu TDP-43, deren direkte Interaktion miteinander, sowie TDP-43 Aggregate in HNRNPA1 Patienten, suggerieren gemeinsame Pathomechanismen dieser Proteine. Zur Studie der physiologischen Funktion von HNRNPA1, HNRNPA2B1 und HNRNPA3, und deren Beitrag zu ALS, wurden Zebrafischmutanten generiert, in welcher die jeweiligen orthologen Gene defekt sind. Die genetische Analyse ergab, dass durch die Teleost spezifische Genomduplikation im Zebrafish zwei HNRNPA1 Orthologe existieren: hnrnpa1a und hnrnpa1b, jedoch kein HNRNPA2B1 Ortholog. Diese Dissertation widmet sich der Erstellung und Charakterisierung der hnrnpa1a, hnrnpa1b und hnrnpa3 Mutanten, sowie deren Gegenüberstellung mit der tardbp-/-; tardbpl-/- Mutante, in welcher die Zebrafisch TDP-43 Orthologe defekt sind. Während die Einzelmutanten von hnrnpa1a, hnrnpa1b, und hnrnpa3 keine Auffälligkeiten zeigen, ist die Doppelmutante von hnrnpa1a und hnrnpa1b embryonal letal. Die Doppelmutante ist zudem entwicklungsverzögert, hat kürzere Motoneurone und degenerierte Muskeln, fehlentwickelte Gefäße mit stark verminderter oder fehlender Durchblutung, sowie eine dünnere Dottersackverlängerung und erhöhte Aufnahme von neutralen Lipiden aus dem Dottersack. Einige dieser phenotypischen Veränderungen, wie zum Beispiel die verkürzten Motoneurone und degenerierten Muskeln, sind auch in tardbp-/-; tardbpl-/- Mutanten präsent. Allerdings, kann man davon ausgehen, dass diese Veränderungen eine unspezifische Folge des sterbenden Embryos darstellen. Die in beiden Mutanten beobachtete Fehlbildung der Gefäße unterscheidet sich zudem, da hnrnpa1a-/-; hnrnpa1b-/- Mutanten laterale Lamellopodien dorsal ausbilden, welche ihren physiologischen Migrationsweg verlassen und fehlerhafte Verbindungen bilden, wohingegen zusätzliche ektopische Endothelzellprozesse aus der dorsalen Aorta charakteristisch für tardbp-/-; tardbpl-/- Mutanten sind. RNA Sequenzierung der hnrnpa1a-/-; hnrnpa1b-/- Doppelmutante identifizierte apolipoprotein (apoda.1) als eines der Gene, dessen Expression am meisten reduziert ist. APOD ist ein Lipidtransporter und besitzt neuroprotektive Eigenschaften zu besitzen. apoda.1 knockdown in Wildtyp-Embryonen führte zu dem gleichen Lipidphenotyp, welcher in hnrnpa1a-/-; hnrnpa1b-/- Mutanten beobachtet wurde. Diese Erkenntnis stellt eine direkte Verbindung zwischen HNRNPA1 Funktionsverlust und reduzierter APOD Expression dar. Wir nehmen an, dass HNRNPA1 ALS Patienten die neuroprotektiv wirkende vermehrte Expression von APOD fehlt, was zur Krankheitheitsentwicklung und Neurodegeneration beisteuert.
Not available
Jansen, Lara
2019
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Jansen, Lara (2019): Generation and functional analysis of the ALS associated HNRNPA zebrafish mutants. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

The neurodegenerative disease amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is clinically characterized by the progressive loss of upper and lower motoneurons and pathologically by the presence of Tar DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43) positive aggregates. The cause of this fatal and rapidly progressing disease, for which effective treatments are lacking, remains still unknown. Increasing evidence points to altered RNA metabolism as a potential pathomechanism due to the high percentage of RNA binding proteins (RBP) encoded by disease causing genes and their aggregation in ALS patients. Mutations in the RBPs Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A1 (HNRNPA1) and HNRNPA2B1 were identified in ALS and Multisystem proteinopathy (MSP) patients. Another member of the HNRNPA family, HNRNPA3, was also linked to ALS due to its ability to bind Chromosome 9 open reading frame 72 (C9ORF72) repeats, and its localization to p62 positive TDP-43 negative C9ORF72 inclusions. The structural similarity of HNRNPA proteins to TDP-43, their ability to bind one another, and the presence of TDP-43 aggregates in HNRNPA1 and HNRNPA2 mutation carriers, suggest common pathomechanisms of these proteins. To unravel the physiological function of HNRNPA1, HNRNA2B1, and HNRNPA3, and their association to ALS, this study aims to establish zebrafish loss of function mutants lacking the orthologues of the corresponding genes. Genetic analysis revealed that due to the teleost specific genome duplication zebrafish possess two HNRNPA1 orthologues named hnrnpa1a and hnrnpa1b, but no HNRNPA2B1 orthologue. In this thesis hnrnpa1a, hnrnpa1b, and hnrnpa3 zebrafish mutants were generated and characterized, and compared to the tardbp-/-; tardbpl-/- mutant, which lacks the zebrafish TDP-43 orthologues. While single hnrnpa1a, hnrnpa1b, and hnrnpa3 knockout (KO) zebrafish are viable and fertile, double hnrnpa1a and hnrnpa1b KO mutants are embryonically lethal. Moreover, the double mutants are developmentally delayed, have shortened motoneuron axons, muscle defects, show vascular mispatterning with reduced or absent blood flow, have a thinned yolk extension and increased neutral lipid uptake from the yolk. Some of these phenotypic alterations, such as shortened motoneurons and degenerated muscles, are also present in tardbp-/-; tardbpl-/- mutants and are presumably a general phenomena preceeding the embryonic lethality. The impaired intersomitic vessels observed in both mutants show distinct characteristics, since hnrnpa1a-/-; hnrnpa1b-/- mutants only develop dorsal lateral lamellopodia, diverting from their physiological migration path and misconnect, whereas tardbp-/-; tardbpl-/- mutants additionally have ectopic endothelial sprouts from the dorsal aorta. RNA sequencing of hnrnpa1a-/-; hnrnpa1b-/- embryos revealed apolipoprotein (apoda.1) as one of the top downregulated genes. APOD is a lipid transporter and was previously shown to be neuroprotective. Upon knockdown of apoda.1 in wildtype embryos we could mimic the lipid phenotype observed in hnrnpa1a-/-; hnrnpa1b-/- mutants. This finding points to a direct link between HNRNPA1 loss of function and downregulation of APOD. We hypothesize that HNRNPA1 ALS patients lack the neuroprotective

Abstract

Die neurodegenerative Erkrankung Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist klinisch durch den Verlust der oberen und unteren Motorneuronen und pathologisch durch die Präsenz von Tar DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43) positiven Aggregaten gekennzeichnet. Die Ursache dieser unheilbaren und schnell fortschreitenden Krankheit ist bisher nicht bekannt. Mehrere Forschungsergebnisse, wie zum Beispiel der große Anteil an aggregierenden RNA bindenden Proteinen (RBPs) und Mutationen in den entsprechenden Genen als Krankheitsursache in ALS Patienten, deuten darauf hin, dass veränderter RNA Metabolismus eine große Rolle in der Krankheitspathogenese spielt. Mutationen in den RBPs Heterogeneous nuklear ribonukleoprotein A1 (HNRNPA1) und HNRNPA2B1 wurden in Multisystem Proteinopathy (MSP) und ALS Patienten identifiziert. Ein weiteres Mitglied der HNRNPA Protein Familie, HNRNPA3, wurde zudem mit ALS assoziiert, da es an Chromosome 9 open reading frame 72 (C9ORF72) Wiederholungssequenzen bindet und mit p62 positiven TDP-43 negativen C9ORF72 Aggregaten kolokalisiert. Die strukturelle Ähnlichkeit der HNRNPA Proteine zu TDP-43, deren direkte Interaktion miteinander, sowie TDP-43 Aggregate in HNRNPA1 Patienten, suggerieren gemeinsame Pathomechanismen dieser Proteine. Zur Studie der physiologischen Funktion von HNRNPA1, HNRNPA2B1 und HNRNPA3, und deren Beitrag zu ALS, wurden Zebrafischmutanten generiert, in welcher die jeweiligen orthologen Gene defekt sind. Die genetische Analyse ergab, dass durch die Teleost spezifische Genomduplikation im Zebrafish zwei HNRNPA1 Orthologe existieren: hnrnpa1a und hnrnpa1b, jedoch kein HNRNPA2B1 Ortholog. Diese Dissertation widmet sich der Erstellung und Charakterisierung der hnrnpa1a, hnrnpa1b und hnrnpa3 Mutanten, sowie deren Gegenüberstellung mit der tardbp-/-; tardbpl-/- Mutante, in welcher die Zebrafisch TDP-43 Orthologe defekt sind. Während die Einzelmutanten von hnrnpa1a, hnrnpa1b, und hnrnpa3 keine Auffälligkeiten zeigen, ist die Doppelmutante von hnrnpa1a und hnrnpa1b embryonal letal. Die Doppelmutante ist zudem entwicklungsverzögert, hat kürzere Motoneurone und degenerierte Muskeln, fehlentwickelte Gefäße mit stark verminderter oder fehlender Durchblutung, sowie eine dünnere Dottersackverlängerung und erhöhte Aufnahme von neutralen Lipiden aus dem Dottersack. Einige dieser phenotypischen Veränderungen, wie zum Beispiel die verkürzten Motoneurone und degenerierten Muskeln, sind auch in tardbp-/-; tardbpl-/- Mutanten präsent. Allerdings, kann man davon ausgehen, dass diese Veränderungen eine unspezifische Folge des sterbenden Embryos darstellen. Die in beiden Mutanten beobachtete Fehlbildung der Gefäße unterscheidet sich zudem, da hnrnpa1a-/-; hnrnpa1b-/- Mutanten laterale Lamellopodien dorsal ausbilden, welche ihren physiologischen Migrationsweg verlassen und fehlerhafte Verbindungen bilden, wohingegen zusätzliche ektopische Endothelzellprozesse aus der dorsalen Aorta charakteristisch für tardbp-/-; tardbpl-/- Mutanten sind. RNA Sequenzierung der hnrnpa1a-/-; hnrnpa1b-/- Doppelmutante identifizierte apolipoprotein (apoda.1) als eines der Gene, dessen Expression am meisten reduziert ist. APOD ist ein Lipidtransporter und besitzt neuroprotektive Eigenschaften zu besitzen. apoda.1 knockdown in Wildtyp-Embryonen führte zu dem gleichen Lipidphenotyp, welcher in hnrnpa1a-/-; hnrnpa1b-/- Mutanten beobachtet wurde. Diese Erkenntnis stellt eine direkte Verbindung zwischen HNRNPA1 Funktionsverlust und reduzierter APOD Expression dar. Wir nehmen an, dass HNRNPA1 ALS Patienten die neuroprotektiv wirkende vermehrte Expression von APOD fehlt, was zur Krankheitheitsentwicklung und Neurodegeneration beisteuert.