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T cell receptor modification by alpha and beta chain domain cross-over for adoptive T cell therapy
T cell receptor modification by alpha and beta chain domain cross-over for adoptive T cell therapy
Adoptive T cell transfer is a novel approach for cancer treatment in which patient’s T lymphocytes are extracted and genetically modified to redirect these against the cancer cell. However, there are still a number of risks and limitations to this approach. One is the formation of autoreactive T cell: The antigen-recognizing part of the T cell receptor is a dimer of an α- and a β-chain. Accordingly, transduced T cells can express ‘mispaired’ T cell receptors that comprise a native and an exogenous chain. These heterodimers can cause autoimmunity if they target self-antigens. The aim of this study was to investigate a novel approach against mispairing by transferring either the variable or the constant domain of one chain across to the other chain. This concept is already successfully employed in the design of bispecific antibodies to avoid mispairing and may be transferable due to a high degree of homology between T cell receptors and antibodies. The transduction of crossed receptors into murine T cells did not result in any surface expression. We observed an intracellular accumulation of α-chains. After a redesign eliminating an interference with the linker sequence, we found a temporary surface expression of α-chains in one of our constructs. However, when transducing only the single chain, we could not detect surface expression. We concluded that, while undetectable, the β-chain must be expressed when transducing with the bicistronic vector and that the crossed T cell receptor assembles correctly with the CD3 subunits. Finally, we aimed at stabilizing surface expression of the crossed receptor. We added an additional disulfide bond between both chains at different locations and changed the exact location of the domain cross-over in the so-called elbow region, which links the variable and the constant domain of each chain. Yet, a sustained surface expression of crossed T cell receptors could not be achieved. Alternative strategies are thus needed to prevent TCR mispairing., Adoptiver T-Zelltransfer ist ein Therapieverfahren, bei dem Patienten-eigene T-Lymphozyten mit einem tumorspezifischen Rezeptor transduziert werden, um eine anti-tumorale Aktivität zu induzieren Trotz vieler Fortschritte birgt dieses Verfahren auch Risiken. Eines ist die Bildung autoreaktiver T-Zellen: Die Erkennungsdomäne des T-Zellrezeptors ist ein Dimer aus α- und β-Kette. Daher kann, durch Hinzufügen eines zweiten T-Zellrezeptors in eine T-Zelle, ein weiteres Dimer aus einer nativen und einer exogenen Kette entstehen. Ein solcher, fehlgepaarter (’mispaired’) Rezeptor kann potenziell neue Antigene erkennen und Autoimmunreaktionen auslösen. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist es eine neuartige T-Zellrezeptormodifikation zum Unterbinden von Mispairing zu untersuchen. Dazu vertauschten wir die konstante oder die variable Domäne zwischen den Ketten (’domain crossover’). Dieses Prinzip wird bereits erfolgreich beim Design von bispezifischen Antikörpern eingesetzt, um Mispairing zu vermeiden und könnte sich dank großer Homologie auf T-Zellrezeptoren übertragen lassen. Bei Transduktion der gekreuzten Rezeptorketten in murine T-Zellen, stellten wir zunächst keine Oberflächenexpression, jedoch eine intrazellulä̈re Akkumulation von gekreuzten α-Ketten fest. Nach Beseitigung einer Interferenz durch die Linkersequenz stellte sich eine temporäre Oberfä̈chenexpression der α-Kette des gekreuzten Rezeptors ein. Transduzierten wir jedoch nur eine einzelne Kette, so war keine Oberflächenexpression nachweisbar. Wir folgerten, dass auch die grundsätzlich nicht mehr detektierbare β-Kette exprimiert wird und sich gekreuzten Ketten erfolgreich mit CD3 Untereinheiten zusammensetzen. Um eine stabile Oberflächenexpression zu ermöglichen, fügten wir Disulfidbrücken ein und veranderten die genaue Kreuzungsstelle innerhalb der Ellbogenregion, welche die variable und konstante Domäne verbindet. Es ließ sich jedoch keine dauerhafte Oberflächenexpression erzielen. Somit sind andere Strategien erforderlich um Mispairing zu verhindern oder zu reduzieren.
T cell, Mispairing, Adoptive Cell Transfer, TCR Engineering, Domain Switch, Domain Crossing
Peters, Philipp
2018
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Peters, Philipp (2018): T cell receptor modification by alpha and beta chain domain cross-over for adoptive T cell therapy. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Adoptive T cell transfer is a novel approach for cancer treatment in which patient’s T lymphocytes are extracted and genetically modified to redirect these against the cancer cell. However, there are still a number of risks and limitations to this approach. One is the formation of autoreactive T cell: The antigen-recognizing part of the T cell receptor is a dimer of an α- and a β-chain. Accordingly, transduced T cells can express ‘mispaired’ T cell receptors that comprise a native and an exogenous chain. These heterodimers can cause autoimmunity if they target self-antigens. The aim of this study was to investigate a novel approach against mispairing by transferring either the variable or the constant domain of one chain across to the other chain. This concept is already successfully employed in the design of bispecific antibodies to avoid mispairing and may be transferable due to a high degree of homology between T cell receptors and antibodies. The transduction of crossed receptors into murine T cells did not result in any surface expression. We observed an intracellular accumulation of α-chains. After a redesign eliminating an interference with the linker sequence, we found a temporary surface expression of α-chains in one of our constructs. However, when transducing only the single chain, we could not detect surface expression. We concluded that, while undetectable, the β-chain must be expressed when transducing with the bicistronic vector and that the crossed T cell receptor assembles correctly with the CD3 subunits. Finally, we aimed at stabilizing surface expression of the crossed receptor. We added an additional disulfide bond between both chains at different locations and changed the exact location of the domain cross-over in the so-called elbow region, which links the variable and the constant domain of each chain. Yet, a sustained surface expression of crossed T cell receptors could not be achieved. Alternative strategies are thus needed to prevent TCR mispairing.

Abstract

Adoptiver T-Zelltransfer ist ein Therapieverfahren, bei dem Patienten-eigene T-Lymphozyten mit einem tumorspezifischen Rezeptor transduziert werden, um eine anti-tumorale Aktivität zu induzieren Trotz vieler Fortschritte birgt dieses Verfahren auch Risiken. Eines ist die Bildung autoreaktiver T-Zellen: Die Erkennungsdomäne des T-Zellrezeptors ist ein Dimer aus α- und β-Kette. Daher kann, durch Hinzufügen eines zweiten T-Zellrezeptors in eine T-Zelle, ein weiteres Dimer aus einer nativen und einer exogenen Kette entstehen. Ein solcher, fehlgepaarter (’mispaired’) Rezeptor kann potenziell neue Antigene erkennen und Autoimmunreaktionen auslösen. Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist es eine neuartige T-Zellrezeptormodifikation zum Unterbinden von Mispairing zu untersuchen. Dazu vertauschten wir die konstante oder die variable Domäne zwischen den Ketten (’domain crossover’). Dieses Prinzip wird bereits erfolgreich beim Design von bispezifischen Antikörpern eingesetzt, um Mispairing zu vermeiden und könnte sich dank großer Homologie auf T-Zellrezeptoren übertragen lassen. Bei Transduktion der gekreuzten Rezeptorketten in murine T-Zellen, stellten wir zunächst keine Oberflächenexpression, jedoch eine intrazellulä̈re Akkumulation von gekreuzten α-Ketten fest. Nach Beseitigung einer Interferenz durch die Linkersequenz stellte sich eine temporäre Oberfä̈chenexpression der α-Kette des gekreuzten Rezeptors ein. Transduzierten wir jedoch nur eine einzelne Kette, so war keine Oberflächenexpression nachweisbar. Wir folgerten, dass auch die grundsätzlich nicht mehr detektierbare β-Kette exprimiert wird und sich gekreuzten Ketten erfolgreich mit CD3 Untereinheiten zusammensetzen. Um eine stabile Oberflächenexpression zu ermöglichen, fügten wir Disulfidbrücken ein und veranderten die genaue Kreuzungsstelle innerhalb der Ellbogenregion, welche die variable und konstante Domäne verbindet. Es ließ sich jedoch keine dauerhafte Oberflächenexpression erzielen. Somit sind andere Strategien erforderlich um Mispairing zu verhindern oder zu reduzieren.