Dissecting the role of proteasome activators in lung biology and disease

Welk, Vanessa (2018): Dissecting the role of proteasome activators in lung biology and disease. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Proteostasis is the cellular control mechanism ensuring the maintenance of a functional proteome, which is essential for proper cellular and organismal function. Being the main proteolytic system of the cell, the proteasome is an indispensable component of the cellular proteostasis network. Proteasomes are large protein complexes consisting of different subcomponents. The 20S proteasome catalytic core particle associates with different proteasome activators, including the 19S regulator and the alternative proteasome activators PA28αβ, PA28γ, or PA200, which open the 20S proteasome gate to facilitate substrate entry into the proteolytic chamber. Whereas the 19S regulator mediates ubiquitin- and ATP-dependent degradation of the majority of cellular proteins, the alternative proteasome activators function in an ubiquitin- and ATP-independent manner. According to the previously proposed building block concept, the recruitment of these proteasome activators to the 20S catalytic core particle allows for the fast adaption of proteasome function in response to cellular stimuli. Although the alternative proteasome activators have been implicated in the degradation of specific substrates, their function and regulation is largely unknown. Here, the regulation of alternative proteasome activators was investigated in lung biology and disease with the particular focus to provide proof-of-concept evidence for the fast regulation of activators upon cellular stimuli and to investigate the dysregulation and function of PA200 in hyperproliferative lung diseases. First, the specificity of a commercially available and widely used PA200 antibody targeting amino acids 1620-1634 of the human protein was analyzed using PA200 silencing in cells as well as tissues from PA200-/- mice. The data provided in this thesis revealed that the 160 kDa protein species detected by the antibody is not an isoform of PA200 as stated previously in the literature. Antibodies targeting different epitopes of the activator specifically recognized the 200 kDa PA200 protein and were used for further experiments. The second study of this thesis analyzed the regulation of alternative proteasome activators in response to proteotoxic stress mediated by inhibition of the proteasome. Here, a rapid recruitment of proteasome activators PA28γ and PA200 to the 20S proteasome was observed in response to inhibition of the 20S catalytic subunits via small molecule inhibitors in primary human lung fibroblasts (phLF). Investigating the underlying mechanism revealed that the recruitment of PA28γ and PA200 was independent from their transcriptional induction at early time points and that the extent of activator recruitment depended on the degree of proteasome inhibition. The rapid assembly of PA28γ and PA200 with 20S proteasome complexes in response to proteasome inhibition thus provides first evidence for a fast regulation of these activators according to cellular needs supporting the building block concept. The third study of this thesis analyzed the regulation and function of PA200 in hyperproliferative tissue remodeling. The results demonstrated upregulation of PA200 protein levels not only in tissues of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) patients as well as in experimentally induced fibrosis of the lung and kidney but also in human biopsies from different types of lung cancer. In IPF tissues the induction of PA200 protein levels specifically localized to myofibroblasts and abnormal hyperplastic basal cells of the bronchial epithelium. LC-MS/MS analysis revealed that the PA200 interactome in phLF strongly adapts according to cellular activation and proliferation involving the interaction of PA200 with ribosomal proteins and heterogeneous nuclear ribonucleoproteins (hnRNPs) in proliferating cells. Transcriptomic and proteomic screens of PA200-silenced phLF revealed pronounced activation of cellular proliferation and survival, which was confirmed in cell culture experiments. In line with this observation, PA200-/- mice showed an improved survival in response to bleomycin-induced lung injury. In summary, the results obtained from these studies provide first evidence for the regulation of alternative proteasome activators PA28γ and PA200 upon different cellular stimuli. This supports the previously stated building block hypothesis suggesting the adaption of proteasome function on the level of activator recruitment to the 20S core particle. In addition, a dysregulation of PA200 in hyperproliferative lung diseases was observed and the activator was discovered to be a novel regulator of fibroblasts activation, proliferation and survival.

Abstract

Proteostase bezeichnet den zellulären Kontrollmechanismus, welcher die Instandhaltung eines funktionellen Proteoms gewährleistet und damit maßgeblich zur physiologischen Funktion von Zellen oder ganzen Organismen beiträgt. Als eines der wichtigsten proteolytischen Systeme der Zelle ist das Proteasom ein essentieller Bestandteil dieses Proteostase-Netzwerks. Proteasomen sind sehr große Proteinkomplexe, welche aus verschiedenen Subkomponenten bestehen. Der 20S Kernpartikel kann mit verschiedenen Proteasomaktivatoren wie dem 19S Regulator oder den alternativen Proteasomaktivatoren PA28αβ, PA28γ, oder PA200 assoziieren, was seine Öffnung induziert und die Aufnahme von Substraten in dessen proteolytische Kammer ermöglicht. Im Gegensatz zum 19S Regulator, der für den Ubiquitin- und ATP-abhängigen Abbau eines Großteils der zellulären Proteine verantwortlich ist, agieren die alternativen Protesomaktivatoren ATP- und Ubiquitin- unabhängig. Gemäß des kürzlich postulierten „Baustein-Konzepts” erlaubt die Rekrutierung dieser Proteasomaktivatoren zum 20S Kernpartikel eine schnelle Adaption der Proteasomfunktion an zelluläre Veränderungen. Die genaue Funktion und Regulation der alternativen Proteasomaktivatoren ist größtenteils unbekannt, obwohl angenommen wird, dass sie den Abbau spezifischer Substrate vermitteln. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurde daher die Regulation alternativer Proteasomaktivatoren in der Lungenphysiologie als auch in Lungenerkrankungen mit dem besonderen Fokus untersucht, einen ersten Nachweis für die vom „Baustein-Konzept“ beschriebene Adaption alternativer Proteasomaktivatoren gemäß zellulärer Stimuli zu erbringen sowie eine potenzielle Dysregulation von PA200 in hyperproliferativen Lungenerkrankungen zu erforschen. In der ersten Studie wurde die Spezifität eines kommerziell erhältlichen und weitverbreiteten PA200 Antikörpers, welcher gegen die Aminosäuren 1620-1634 des humanen Proteins gerichtet ist, mittels siRNA-vermittelter Herabregulierung der PA200 Expression sowie in Geweben von PA200-/- Mäusen untersucht. Diese Analyse ergab, dass dieser Antikörper eine Proteinspezies von 160 kDa detektiert, welche im Gegensatz zur bisherigen Einschätzung der Literatur keine Isoform von PA200 darstellt, weshalb dieser Antikörper nicht für die spezifische Detektion von PA200 geeignet ist. Da die Spezifität anderer PA200 Antikörper, welche gegen andere Epitope des Proteins gerichtet sind, bestätigt werden konnte, wurden diese in den weiteren Experimenten verwendet. In der zweiten Studie wurde die Regulierung alternativer Proteasomaktivatoren bei proteotoxischem Stress untersucht, der durch Proteasomhemmung erzeugt wurde. Die Inaktivierung der katalytischen 20S Untereinheiten durch nierdermolekulare Inhibitoren verursachte eine schnelle Rekrutierung der Proteasomaktivatoren PA28γ und PA200 an das 20S Proteasom in primären humanen Lungenfibroblasten (phLF). Die Untersuchung des zugrundeliegenden Mechanismus ergab, dass die Rekrutierung von PA28γ und PA200 unabhängig von einer transkriptionellen Hochregulation der Aktivatoren induziert wurde und dass die Rekrutierung vom Grad der Proteasominaktivierung abhing. Die rasche Assemblierung von PA28γ und PA200 mit dem 20S Proteasomkomplex bei Inhibierung des Proteasoms bestätigt somit die schnelle Regulation der Proteasomfunktion gemäß des „Baustein-Konzepts“. Die dritte Studie dieser Dissertation untersuchte die Regulation und Funktion von PA200 in hyperproliferativen Lungenerkrankungen. Die hierfür durchgeführten Studien zeigten eine Hochregulation von PA200 in fibrotischen Geweben der idiopathischen Lungenfibrose (IPF), experimentell-induzierter Fibrose von Lunge oder Niere sowie verschiedener Arten humaner Lungentumore. Die histologische Analyse von IPF Geweben zeigte insbesondere eine Erhöhung des PA200 Proteingehalts in Myofibroblasten und abnormalen hyperplastischen Basalzellen des Bronchialepitheliums. Mittels LC-MS/MS Analyse konnte eine deutliche Regulation des PA200 Interaktoms gemäß der zellulären Aktivierung und Proliferation festgestellt werden, wobei PA200 in proliferierenden Zellen vor allem mit ribsosomalen Proteinen und heterogenen nukleären Ribonucleoproteinen (hnRNP) interagierte. Die Transkriptom- sowie Proteom-Analyse von phLF mit siRNA-vermittelter Herabregulation von PA200 ergab eine deutliche Aktivierung der Proliferation und des Überlebensprogramms der Zellen, was mittels Zellkulturexperimenten bestätigt werden konnte. Außerdem zeigten PA200-/- Mäuse eine erhöhte Überlebensrate bei einer Bleomycin-induzierten Lungenschädigung im Vergleich zu Wildtyptieren. Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse dieser Dissertation die Regulation von PA28γ und PA200 gemäß bestimmter zellulärer Stimuli und erbringen somit eine erst Validierung des „Baustein-Konzepts“ hinsichtlich der alternativen Proteasomaktivatoren. Zudem wurde erstmalig eine Dysregulation von PA200 im Krankheitskontext beobachtet und eine bisher unbekannte Funktion des Aktivators als Regulator der Aktivierung, Proliferation und des Überlebens von Zellen entdeckt.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: proteasome idiopathic pulmonary fibrosis, PA200 proteasome activator
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 2. März 2018
• 1. Bericht­erstatter:in: Meiners, Silke