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Translation of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) upon liver and lung targeted delivery of optimized chemically modified mRNA
Translation of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) upon liver and lung targeted delivery of optimized chemically modified mRNA
Changes in lifestyle and environmental conditions give rise to increasing prevalence of liver and lung fibrosis, both having poor prognosis. Investigations about the underlying mechanisms of fibrosis revealed a dysbalance of the local renin angiotensin system (RAS) actively contributing to inflammation and fibrosis. The carboxypeptidase angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) is a family member of the RAS showing high potential to reestablish RAS balance leading to resolution of inflammation and fibrosis. So far, first promising results in experimental liver and lung fibrosis have been reported upon administration of recombinant ACE2 protein or ACE2 gene therapy. However, recombinant protein and gene therapy struggle with hurdles such as organ-targeted delivery, limited or challenging control of protein expression and immunogenicity among others. These obstacles may be overcome with latest advances in RNA transcript therapy (RTT). The goal of this project was to establish strong and sustained ACE2 protein expression selectively in healthy and fibrotic liver and lung tissues. Special attention was paid on the protein being stably integrated into the cell membrane, a prerequisite for local enzymatic activity. For this purpose, in vitro transcribed chemically modified ACE2 mRNA (cmRNA) was designed and profound in vitro cmRNA transfection efficiency, protein expression and activity was shown. With the aim of organ targeted ACE2 protein expression, close investigations about protein maturation were performed indicating full glycosylation and correct folding of protein leading to trafficking and correct protein integration in the cell membrane. In parallel, several ACE2 cmRNA sequences were screened for strong and sustained protein expression in liver and lung cells and the best performing sequence was used for the following in vivo studies. For organ targeted delivery, the optimal combination of carrier and application route was determined by application of reporter protein cmRNA and evaluation of resulting protein expression. For liver targeted cmRNA delivery, systemic application of lipidoid based formulations led to selective protein expression in the liver. For lung targeted cmRNA expression, polymer and lipidoid based formulations were investigated for nebulization, intratracheal microspray or systemic application. In the context of ACE2 expression in fibrotic lungs and based on the results achieved by intravenous administration, systemic application was identified as the optimal administration route. In a next step, both liver and lung specific delivery agents were formulated with ACE2 cmRNA and intravenously applied leading to liver or lung targeted translation of significant amounts of ACE2 protein. Finally, these formulations were applied in two experimental models of liver and lung fibrosis and could show successful delivery of ACE2 cmRNA to liver or lung respectively. In addition, first data about protein kinetics as well as requirements for dosing and carrier selection in future preclinical studies could be collected. In summary, an optimized ACE2 cmRNA sequence for liver and lung targeted ACE2 expression could be identified in this thesis. In vivo application in liver and lung targeted formulations led to strong protein expression in these organs, providing evidence that RTT is a promising approach for ACE2 based treatment of liver and lung fibrosis to be further explored in fibrotic disease models., Ungesunder Lebensstil und Umwelteinflüsse führen zu kontinuierlich steigender Prävalenz von Leber- und Lungenfibrose, beide mit schlechten bis nicht vorhandenen Heilungsaussichten für die Patienten. Untersuchungen über die zugrunde liegenden Mechanismen fibrotischer Krankheiten zeigten ein deutliches Ungleichgewicht im lokalen Renin-Angiotensin-Systems (RAS) der betroffenen Organe, was erheblich zu Entzündungsreaktionen und daraus resultierender Fibrose beiträgt. In diesem Kontext nimmt ACE2 (Angiotensin Converting Enzyme 2) – eine Carboxypeptidase innerhalb des RAS - eine spezielle Rolle ein, da sie durch ihre Funktionalität über großes Potential zur Auflösung von Entzündung und Fibrose verfügt. Dies wurde durch erste vielversprechende Daten in experimentellen Leber- und Lungenfibrosemodellen nach Behandlung mit rekombinantem ACE2 Protein oder ACE2 Gentherapie belegt. Für beide Therapieformen gibt es jedoch eine Reihe ungelöster Problemstellungen, wie organspezifische Verabreichung, Kontrollierbarkeit der Proteinexpression und Immunogenität. Durch die aktuellen Entwicklungen in der RNA Transkripttherapie (RTT) erschließen sich dafür nun neue Lösungsansätze. Zielsetzung dieser Arbeit war die Etablierung von profunder und selektiver ACE2 Proteinexpression sowohl in gesundem als auch fibrotischem Leber- und Lungengewebe. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf korrekte Proteinintegration in die Zellmembran gelegt, da es sich dabei um eine unabdingbare Voraussetzung für die lokale Enzymaktivität handelt. Zu diesem Zweck wurde im ersten Schritt in vitro transkribierte chemisch modifizierte ACE2 mRNA (cmRNA) entwickelt und einer umfassenden in vitro Analyse bestehend aus Evaluation der Transfektionseffizienz, Proteinexpression und Proteinaktivität unterzogen. Um eine organspezifische lokale ACE2 Proteinexpression zu garantieren wurden weiterführende Analysen der Proteinreifung durchgeführt. Damit konnte sowohl die vollständige Glycosylierung als auch korrekte Faltung des Proteins bestätigt werden, was zur korrekten Proteinintegration in die Zellmembrane führte. Gleichzeitig wurden mehrere ACE2 cmRNA Sequenzen einem Screening zur Bestimmung von Proteinexpressionsstärke und –dauer unterzogen und daraus die optimale Sequenz für weiterführende in vivo Analysen identifiziert. Im nächsten Schritt wurde mittels Reporterprotein cmRNA und daraus resultierender Proteinexpression die optimale Kombination von Carrier und Applikationsroute für die organspezifische Proteinexpression ermittelt. In der Leber konnte selektive und organspezifische Proteinexpression durch systemischer Applikation lipidoidbasierter Formulierungen erzielt werden. Für lungenspezifische Proteinexpression wurden polymer- und lipidoidbasierte Formulierungen für Nebulisierung, intratrachealer Mikrosprayapplikation oder systemischer Applikation untersucht. Dabei wurde basierend auf diesen Ergebnissen und im Kontext der ACE2 Expression in fibrotischen Lungen die systemischen Applikation als optimale Route identifiziert. Im nächsten Schritt wurde in den Formulierungen die Reporterprotein cmRNA mit ACE2 cmRNA ersetzt, womit nach intravenöser Verabreichung sowohl in der Leber als auch der Lunge starke ACE2 Proteinexpression nachweisbar war. Diese Formulierungen wurden anschließend in zwei experimentellen Modellen der Leber- und Lungenfibrose angewandt, wobei die erfolgreiche Anreicherung von ACE2 cmRNA in Leber beziehungsweise Lunge nachgewiesen werden konnte. Zusätzlich konnten erste Daten zur Proteinkinetik als auch cmRNA Dosierung und Carrierauswahl für zukünftige präklinische Studien erhoben werden. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit eine optimierte ACE2 cmRNA Sequenz zur leber- und lungenspezifischen ACE2 Expression etabliert werden. Leber- und lungenspezifischer Formulierungen und anschließende in vivo Applikation dieser cmRNA führten zu signifikanter Proteinexpression in den Zielorganen. Damit erweist sich die RTT als vielversprechender Ansatz für die ACE2 basierte Behandlung von Leber- und Lungenfibrose, was es nun in fibrotischen Krankheitsmodellen weiter zu entwickeln gilt.
ACE2, RNA therapy, cmRNA, modified mRNA, mRNA delivery
Schrom, Eva
2017
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Schrom, Eva (2017): Translation of angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) upon liver and lung targeted delivery of optimized chemically modified mRNA. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Changes in lifestyle and environmental conditions give rise to increasing prevalence of liver and lung fibrosis, both having poor prognosis. Investigations about the underlying mechanisms of fibrosis revealed a dysbalance of the local renin angiotensin system (RAS) actively contributing to inflammation and fibrosis. The carboxypeptidase angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) is a family member of the RAS showing high potential to reestablish RAS balance leading to resolution of inflammation and fibrosis. So far, first promising results in experimental liver and lung fibrosis have been reported upon administration of recombinant ACE2 protein or ACE2 gene therapy. However, recombinant protein and gene therapy struggle with hurdles such as organ-targeted delivery, limited or challenging control of protein expression and immunogenicity among others. These obstacles may be overcome with latest advances in RNA transcript therapy (RTT). The goal of this project was to establish strong and sustained ACE2 protein expression selectively in healthy and fibrotic liver and lung tissues. Special attention was paid on the protein being stably integrated into the cell membrane, a prerequisite for local enzymatic activity. For this purpose, in vitro transcribed chemically modified ACE2 mRNA (cmRNA) was designed and profound in vitro cmRNA transfection efficiency, protein expression and activity was shown. With the aim of organ targeted ACE2 protein expression, close investigations about protein maturation were performed indicating full glycosylation and correct folding of protein leading to trafficking and correct protein integration in the cell membrane. In parallel, several ACE2 cmRNA sequences were screened for strong and sustained protein expression in liver and lung cells and the best performing sequence was used for the following in vivo studies. For organ targeted delivery, the optimal combination of carrier and application route was determined by application of reporter protein cmRNA and evaluation of resulting protein expression. For liver targeted cmRNA delivery, systemic application of lipidoid based formulations led to selective protein expression in the liver. For lung targeted cmRNA expression, polymer and lipidoid based formulations were investigated for nebulization, intratracheal microspray or systemic application. In the context of ACE2 expression in fibrotic lungs and based on the results achieved by intravenous administration, systemic application was identified as the optimal administration route. In a next step, both liver and lung specific delivery agents were formulated with ACE2 cmRNA and intravenously applied leading to liver or lung targeted translation of significant amounts of ACE2 protein. Finally, these formulations were applied in two experimental models of liver and lung fibrosis and could show successful delivery of ACE2 cmRNA to liver or lung respectively. In addition, first data about protein kinetics as well as requirements for dosing and carrier selection in future preclinical studies could be collected. In summary, an optimized ACE2 cmRNA sequence for liver and lung targeted ACE2 expression could be identified in this thesis. In vivo application in liver and lung targeted formulations led to strong protein expression in these organs, providing evidence that RTT is a promising approach for ACE2 based treatment of liver and lung fibrosis to be further explored in fibrotic disease models.

Abstract

Ungesunder Lebensstil und Umwelteinflüsse führen zu kontinuierlich steigender Prävalenz von Leber- und Lungenfibrose, beide mit schlechten bis nicht vorhandenen Heilungsaussichten für die Patienten. Untersuchungen über die zugrunde liegenden Mechanismen fibrotischer Krankheiten zeigten ein deutliches Ungleichgewicht im lokalen Renin-Angiotensin-Systems (RAS) der betroffenen Organe, was erheblich zu Entzündungsreaktionen und daraus resultierender Fibrose beiträgt. In diesem Kontext nimmt ACE2 (Angiotensin Converting Enzyme 2) – eine Carboxypeptidase innerhalb des RAS - eine spezielle Rolle ein, da sie durch ihre Funktionalität über großes Potential zur Auflösung von Entzündung und Fibrose verfügt. Dies wurde durch erste vielversprechende Daten in experimentellen Leber- und Lungenfibrosemodellen nach Behandlung mit rekombinantem ACE2 Protein oder ACE2 Gentherapie belegt. Für beide Therapieformen gibt es jedoch eine Reihe ungelöster Problemstellungen, wie organspezifische Verabreichung, Kontrollierbarkeit der Proteinexpression und Immunogenität. Durch die aktuellen Entwicklungen in der RNA Transkripttherapie (RTT) erschließen sich dafür nun neue Lösungsansätze. Zielsetzung dieser Arbeit war die Etablierung von profunder und selektiver ACE2 Proteinexpression sowohl in gesundem als auch fibrotischem Leber- und Lungengewebe. Dabei wurde besonderes Augenmerk auf korrekte Proteinintegration in die Zellmembran gelegt, da es sich dabei um eine unabdingbare Voraussetzung für die lokale Enzymaktivität handelt. Zu diesem Zweck wurde im ersten Schritt in vitro transkribierte chemisch modifizierte ACE2 mRNA (cmRNA) entwickelt und einer umfassenden in vitro Analyse bestehend aus Evaluation der Transfektionseffizienz, Proteinexpression und Proteinaktivität unterzogen. Um eine organspezifische lokale ACE2 Proteinexpression zu garantieren wurden weiterführende Analysen der Proteinreifung durchgeführt. Damit konnte sowohl die vollständige Glycosylierung als auch korrekte Faltung des Proteins bestätigt werden, was zur korrekten Proteinintegration in die Zellmembrane führte. Gleichzeitig wurden mehrere ACE2 cmRNA Sequenzen einem Screening zur Bestimmung von Proteinexpressionsstärke und –dauer unterzogen und daraus die optimale Sequenz für weiterführende in vivo Analysen identifiziert. Im nächsten Schritt wurde mittels Reporterprotein cmRNA und daraus resultierender Proteinexpression die optimale Kombination von Carrier und Applikationsroute für die organspezifische Proteinexpression ermittelt. In der Leber konnte selektive und organspezifische Proteinexpression durch systemischer Applikation lipidoidbasierter Formulierungen erzielt werden. Für lungenspezifische Proteinexpression wurden polymer- und lipidoidbasierte Formulierungen für Nebulisierung, intratrachealer Mikrosprayapplikation oder systemischer Applikation untersucht. Dabei wurde basierend auf diesen Ergebnissen und im Kontext der ACE2 Expression in fibrotischen Lungen die systemischen Applikation als optimale Route identifiziert. Im nächsten Schritt wurde in den Formulierungen die Reporterprotein cmRNA mit ACE2 cmRNA ersetzt, womit nach intravenöser Verabreichung sowohl in der Leber als auch der Lunge starke ACE2 Proteinexpression nachweisbar war. Diese Formulierungen wurden anschließend in zwei experimentellen Modellen der Leber- und Lungenfibrose angewandt, wobei die erfolgreiche Anreicherung von ACE2 cmRNA in Leber beziehungsweise Lunge nachgewiesen werden konnte. Zusätzlich konnten erste Daten zur Proteinkinetik als auch cmRNA Dosierung und Carrierauswahl für zukünftige präklinische Studien erhoben werden. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit eine optimierte ACE2 cmRNA Sequenz zur leber- und lungenspezifischen ACE2 Expression etabliert werden. Leber- und lungenspezifischer Formulierungen und anschließende in vivo Applikation dieser cmRNA führten zu signifikanter Proteinexpression in den Zielorganen. Damit erweist sich die RTT als vielversprechender Ansatz für die ACE2 basierte Behandlung von Leber- und Lungenfibrose, was es nun in fibrotischen Krankheitsmodellen weiter zu entwickeln gilt.