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Chromatin-dependent pre-replication complex positioning and activation in mammals
Chromatin-dependent pre-replication complex positioning and activation in mammals
Mit jeder Zellteilung muss das Genom exakt dupliziert werden. Zehntausende Replikationsinitiationsstellen sind bei der Replikation des gesamten humanen Genoms beteiligt. Die Aktivierung der Initiationsstellen ist präzise reguliert und umfassende Genom-weite Studien haben verschiedene genomische Faktoren identifiziert, die die Aktivierung der Replikationsinitiationsstellen beeinflussen. Der Prä-Replikationskomplex (pre-RC) bildet die Grundlage der Replikationsinitiation und besteht aus zwei Hauptuntereinheiten: der „origin recognition complex“ (ORC) bindet DNS und wird zum Laden der zweiten Untereinheit, den Mcm2-7 Helikasen benötigt, die die eigentliche Replikationsinitiation veranlassen. Während die Regulation des pre-RC Aufbaus vielfach untersucht wurde und mittlerweile gut verstanden wird, sind die Chromatinkomponenten, welche die Positionierung der pre-RCs regulieren, weitgehend unbekannt. Die wenigen Genom-weiten pre-RC Chromatin Immunopräzipitations- und Sequenzierungsstudien (ChIP-seq), behandeln bis heute nur ORC. Da sich Mcm2-7 allerdings von seiner initialen Ladeposition fortbewegen kann, werden vor allem die Genom-weiten Positionen von Mcm2-7 benötigt, um die Regulation der DNS Replikation vollständig zu verstehen. Diese Arbeit umfasst die erste Genom-weite pre-RC ChIP-seq Analyse der zwei pre-RC Hauptkomponenten ORC und Mcm2-7 in der Epstein-Barr Virus (EBV) infizierten Burkitt-Lymphom Zelllinie Raji. Als Qualitätskontrolle für erfolgreiche ChIPs wurden die aus den vorliegenden Experimenten bestimmten pre-RC Positionen auf dem EBV-Genom mit bereits bekannten pre-RC Positionen verglichen. Auf dem humanen Genom korrelierten die pre-RC ChIP Ergebnisse mit aktiven Replikationszonen, während Replikationsterminationszonen eine spezifische Abnahme der pre-RC Komponenten, besonders von Mcm2-7, aufzeigten. Es ist bereits bekannt, dass aktive Replikation mit aktiver Transkription korreliert. Starke pre-RC Bindung war in der Tat hauptsächlich an Regulationsstellen der aktiven Transkription zu finden, was vermutlich durch die Zugänglichkeit des Chromatins determiniert wird. Starke Mcm2-7 Bindung variierte dabei in Abhängigkeit des Zellzyklus, was für Mcm2-7 Translokationen während der G1 Phase spricht, die vermutlich von der aktiven Transkriptionsmaschinerie beeinflusst werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ORC und Mcm2-7 Positionen in der aktiven Chromatinumgebung hauptsächlich von der Zugänglichkeit des Chromatins abhängen und Mcm2-7 die Hauptkomponente der Bestimmung der Replikationsinitiationsstellen darstellt. In Heterochromatin assoziierte vorwiegend ORC mit der heterochromatischen Histonmodifikation H4K20me3, während Mcm2-7 weniger Anreicherung zeigte. Unter Verwendung eines Plasmid-basierten Replikationssystems wurde bestätigt, dass diese ORC-Chromatin Assoziation einen essentiellen Einfluss auf die Regulation der pre-RC Positionierung und Aktivierung ausübt. Dieses Ergebnis zeigt, dass ORC-Chromatin Interaktionen einen entscheidenden Faktor für die Regulation der Replikation in Heterochromatin darstellen. Zusammenfassed schlägt diese Studie zwei verschiedene Modi der pre-RC Positionierung vor, welche jeweils vom Chromatinkontext abhängen., Chaque division cellulaire requiert une duplication précise du génome. Des dizaines de milliers de sites d’initiation de la réplication d’ADN (origines de réplication) sont impliqués dans la réplication complète du génome humain. L’activation des origines de réplication est régulée précisément et des études génomiques extensives ont démontré la présence de caractéristiques génomiques associées à l’activation des origines de réplication. Le complexe de pré-réplication (pre-RC) est la base de l’initiation de la réplication et consiste en deux sous-complexes majeurs : l’ « origin recognition complex » (ORC) qui interagit directement avec l'ADN et est nécessaire pour recruter le second sous-complexe, les hélicases Mcm2-7, qui sont responsables de l'initiation de la réplication. La régulation de l’assemblage du pre-RC est bien étudiée, mais les caractéristiques de la chromatine qui déterminent le positionnement du pre-RC sur le génome restent peu connues. Les études génomiques par immuno-précipitation de la chromatine et séquençage à haut débit (ChIP-seq) des pre-RCs sont rares et jusqu’à aujourd’hui seulement disponibles pour ORC. Du fait que Mcm2-7 migre de son site de chargement initial, il est crucial d'obtenir des informations sur le positionnement des Mcm2-7 pour la compréhension complète de la régulation de la réplication. Ce travail présente la première analyse génomique par méthode ChIP-seq des deux sous-unités majeures du pre-RC, ORC et Mcm2-7, dans la lignée cellulaire de lymphome de Burkitt Raji infectée par le virus d’Epstein-Barr (EBV). La présence du génome d’EBV permet d'avoir un contrôle interne de la qualité de nos expériences, en comparant les positions de pre-RC déterminées avec des positions du pre-RC précédemment publiées. Sur le génome humain, les résultats de séquençage du pre-RC corrèlent bien avec des zones de réplication active. De façon intéressante, les zones de terminaison de la réplication étaient spécifiquement bas en pre-RC, spécialement en Mcm2-7. La localisation des sites d'initiation de la réplication identifiés est généralement bien corrélée avec les sites de transcription active. En effet, des sites d’assemblage du pre-RC de haute affinité sont localisés préférentiellement en voisinage de sites de transcription active, ce qui est possiblement dû à l’accessibilité de la chromatine dans ces régions. La fixation de Mcm2-7 fluctuait de façon dépendante du cycle cellulaire, ce qui suggère des translocations de Mcm2-7 en G1, probablement dépendantes de la machinerie active de la transcription. Ces résultats indiquent que les positions de ORC et Mcm2-7 sont principalement dépendantes de l’accessibilité de la chromatine avec un accès privilégié dans la chromatine active et Mcm2-7 étant le déterminant majeur de l’initiation de la réplication. Au sein de l'hétérochromatine, ORC était enrichi dans des zones associées avec l'histone modifié H4K20me3. Cependant, cet enrichissement était moins important pour les Mcm2-7. En utilisant un système de réplication basé sur des plasmides, nous avons démontré que l’association d'ORC et H4K20me3 favorise l’assemblage du pre-RC et l’initiation de la réplication. Cette observation suggère que l’interaction ORC-chromatine est le déterminant majeur de la régulation de la réplication d’ADN au sein de l’hétérochromatine. En conclusion, cette étude propose deux mécanismes différents de la régulation de l'assemblage du pre-RC dépendants de l’environnement de la chromatine., With every cell division, the genome needs to be faithfully duplicated. Tens of thousands of DNA replication initiation sites (origins of replication) are invoved in replicating the human genome. Origin activation is precisely regulated and extensive genome-wide studies found association of origin activation to several different genomic features. The pre-replication complex (pre-RC) is the basis for replication initiation and consists of two major subcomponents: the origin recognition complex (ORC) binds DNA and is required for loading of the second component, Mcm2-7 helicases, which initiate DNA replication. Regulation of pre-RC assembly is well studied, however, chromatin features driving pre-RC positioning on the human genome remain largely unknown. Genome-wide pre-RC chromatin immunoprecipitation experiments followed by sequencing (ChIP-seq) studies are rare and so far only performed for ORC. As Mcm2-7 can translocate from their initial loading site, information about Mcm2-7 positioning are required for full understanding of DNA replication regulation. This work presents the first genome-wide ChIP-seq analysis of the two major pre-RC subcomponents ORC and Mcm2-7 in the Epstein-Barr virus (EBV) infected Burkitt’s lymphoma cell line Raji. Successful ChIPs were validated on the EBV genome by comparing obtained pre-RC positions with already existing pre-RC ChIP-on chip data. On the human genome, pre-RC sequencing results nicely correlated with zones of active replication. Interestingly, zones of replication termination were specifically depleted from pre-RC components, especially from Mcm2-7. Active DNA replication is known to correlate with active transcription. Indeed, strong pre-RC assembly preferentially occurred at sites of active transcriptional regulation, presumably determined by chromatin accessibility. Strong Mcm2-7 binding thereby fluctuated cell cycle-dependently, arguing for Mcm2-7 translocations during G1, possibly depending on the active transcriptional machinery. These results indicate ORC and Mcm2-7 positions being mainly dependent on chromatin accessibility in active chromatin, with Mcm2-7 being the major determinant of replication initiation. In heterochromatin, ORC was enriched at H4K20me3 sites, while Mcm2-7 enrichment was less prominent. Employing a plasmid-based replication system, ORC association to H4K20me3 was proven to promote successful pre-RC assembly and replication initiation, situating direct ORC-chromatin interactions being the major determinant for DNA replication regulation in heterochromatin. Taken together, this study proposes two different modes of pre-RC assembly regulation depending on chromatin environment.
Not available
Kirstein, Nina
2017
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Kirstein, Nina (2017): Chromatin-dependent pre-replication complex positioning and activation in mammals. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Mit jeder Zellteilung muss das Genom exakt dupliziert werden. Zehntausende Replikationsinitiationsstellen sind bei der Replikation des gesamten humanen Genoms beteiligt. Die Aktivierung der Initiationsstellen ist präzise reguliert und umfassende Genom-weite Studien haben verschiedene genomische Faktoren identifiziert, die die Aktivierung der Replikationsinitiationsstellen beeinflussen. Der Prä-Replikationskomplex (pre-RC) bildet die Grundlage der Replikationsinitiation und besteht aus zwei Hauptuntereinheiten: der „origin recognition complex“ (ORC) bindet DNS und wird zum Laden der zweiten Untereinheit, den Mcm2-7 Helikasen benötigt, die die eigentliche Replikationsinitiation veranlassen. Während die Regulation des pre-RC Aufbaus vielfach untersucht wurde und mittlerweile gut verstanden wird, sind die Chromatinkomponenten, welche die Positionierung der pre-RCs regulieren, weitgehend unbekannt. Die wenigen Genom-weiten pre-RC Chromatin Immunopräzipitations- und Sequenzierungsstudien (ChIP-seq), behandeln bis heute nur ORC. Da sich Mcm2-7 allerdings von seiner initialen Ladeposition fortbewegen kann, werden vor allem die Genom-weiten Positionen von Mcm2-7 benötigt, um die Regulation der DNS Replikation vollständig zu verstehen. Diese Arbeit umfasst die erste Genom-weite pre-RC ChIP-seq Analyse der zwei pre-RC Hauptkomponenten ORC und Mcm2-7 in der Epstein-Barr Virus (EBV) infizierten Burkitt-Lymphom Zelllinie Raji. Als Qualitätskontrolle für erfolgreiche ChIPs wurden die aus den vorliegenden Experimenten bestimmten pre-RC Positionen auf dem EBV-Genom mit bereits bekannten pre-RC Positionen verglichen. Auf dem humanen Genom korrelierten die pre-RC ChIP Ergebnisse mit aktiven Replikationszonen, während Replikationsterminationszonen eine spezifische Abnahme der pre-RC Komponenten, besonders von Mcm2-7, aufzeigten. Es ist bereits bekannt, dass aktive Replikation mit aktiver Transkription korreliert. Starke pre-RC Bindung war in der Tat hauptsächlich an Regulationsstellen der aktiven Transkription zu finden, was vermutlich durch die Zugänglichkeit des Chromatins determiniert wird. Starke Mcm2-7 Bindung variierte dabei in Abhängigkeit des Zellzyklus, was für Mcm2-7 Translokationen während der G1 Phase spricht, die vermutlich von der aktiven Transkriptionsmaschinerie beeinflusst werden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ORC und Mcm2-7 Positionen in der aktiven Chromatinumgebung hauptsächlich von der Zugänglichkeit des Chromatins abhängen und Mcm2-7 die Hauptkomponente der Bestimmung der Replikationsinitiationsstellen darstellt. In Heterochromatin assoziierte vorwiegend ORC mit der heterochromatischen Histonmodifikation H4K20me3, während Mcm2-7 weniger Anreicherung zeigte. Unter Verwendung eines Plasmid-basierten Replikationssystems wurde bestätigt, dass diese ORC-Chromatin Assoziation einen essentiellen Einfluss auf die Regulation der pre-RC Positionierung und Aktivierung ausübt. Dieses Ergebnis zeigt, dass ORC-Chromatin Interaktionen einen entscheidenden Faktor für die Regulation der Replikation in Heterochromatin darstellen. Zusammenfassed schlägt diese Studie zwei verschiedene Modi der pre-RC Positionierung vor, welche jeweils vom Chromatinkontext abhängen.

Abstract

Chaque division cellulaire requiert une duplication précise du génome. Des dizaines de milliers de sites d’initiation de la réplication d’ADN (origines de réplication) sont impliqués dans la réplication complète du génome humain. L’activation des origines de réplication est régulée précisément et des études génomiques extensives ont démontré la présence de caractéristiques génomiques associées à l’activation des origines de réplication. Le complexe de pré-réplication (pre-RC) est la base de l’initiation de la réplication et consiste en deux sous-complexes majeurs : l’ « origin recognition complex » (ORC) qui interagit directement avec l'ADN et est nécessaire pour recruter le second sous-complexe, les hélicases Mcm2-7, qui sont responsables de l'initiation de la réplication. La régulation de l’assemblage du pre-RC est bien étudiée, mais les caractéristiques de la chromatine qui déterminent le positionnement du pre-RC sur le génome restent peu connues. Les études génomiques par immuno-précipitation de la chromatine et séquençage à haut débit (ChIP-seq) des pre-RCs sont rares et jusqu’à aujourd’hui seulement disponibles pour ORC. Du fait que Mcm2-7 migre de son site de chargement initial, il est crucial d'obtenir des informations sur le positionnement des Mcm2-7 pour la compréhension complète de la régulation de la réplication. Ce travail présente la première analyse génomique par méthode ChIP-seq des deux sous-unités majeures du pre-RC, ORC et Mcm2-7, dans la lignée cellulaire de lymphome de Burkitt Raji infectée par le virus d’Epstein-Barr (EBV). La présence du génome d’EBV permet d'avoir un contrôle interne de la qualité de nos expériences, en comparant les positions de pre-RC déterminées avec des positions du pre-RC précédemment publiées. Sur le génome humain, les résultats de séquençage du pre-RC corrèlent bien avec des zones de réplication active. De façon intéressante, les zones de terminaison de la réplication étaient spécifiquement bas en pre-RC, spécialement en Mcm2-7. La localisation des sites d'initiation de la réplication identifiés est généralement bien corrélée avec les sites de transcription active. En effet, des sites d’assemblage du pre-RC de haute affinité sont localisés préférentiellement en voisinage de sites de transcription active, ce qui est possiblement dû à l’accessibilité de la chromatine dans ces régions. La fixation de Mcm2-7 fluctuait de façon dépendante du cycle cellulaire, ce qui suggère des translocations de Mcm2-7 en G1, probablement dépendantes de la machinerie active de la transcription. Ces résultats indiquent que les positions de ORC et Mcm2-7 sont principalement dépendantes de l’accessibilité de la chromatine avec un accès privilégié dans la chromatine active et Mcm2-7 étant le déterminant majeur de l’initiation de la réplication. Au sein de l'hétérochromatine, ORC était enrichi dans des zones associées avec l'histone modifié H4K20me3. Cependant, cet enrichissement était moins important pour les Mcm2-7. En utilisant un système de réplication basé sur des plasmides, nous avons démontré que l’association d'ORC et H4K20me3 favorise l’assemblage du pre-RC et l’initiation de la réplication. Cette observation suggère que l’interaction ORC-chromatine est le déterminant majeur de la régulation de la réplication d’ADN au sein de l’hétérochromatine. En conclusion, cette étude propose deux mécanismes différents de la régulation de l'assemblage du pre-RC dépendants de l’environnement de la chromatine.

Abstract

With every cell division, the genome needs to be faithfully duplicated. Tens of thousands of DNA replication initiation sites (origins of replication) are invoved in replicating the human genome. Origin activation is precisely regulated and extensive genome-wide studies found association of origin activation to several different genomic features. The pre-replication complex (pre-RC) is the basis for replication initiation and consists of two major subcomponents: the origin recognition complex (ORC) binds DNA and is required for loading of the second component, Mcm2-7 helicases, which initiate DNA replication. Regulation of pre-RC assembly is well studied, however, chromatin features driving pre-RC positioning on the human genome remain largely unknown. Genome-wide pre-RC chromatin immunoprecipitation experiments followed by sequencing (ChIP-seq) studies are rare and so far only performed for ORC. As Mcm2-7 can translocate from their initial loading site, information about Mcm2-7 positioning are required for full understanding of DNA replication regulation. This work presents the first genome-wide ChIP-seq analysis of the two major pre-RC subcomponents ORC and Mcm2-7 in the Epstein-Barr virus (EBV) infected Burkitt’s lymphoma cell line Raji. Successful ChIPs were validated on the EBV genome by comparing obtained pre-RC positions with already existing pre-RC ChIP-on chip data. On the human genome, pre-RC sequencing results nicely correlated with zones of active replication. Interestingly, zones of replication termination were specifically depleted from pre-RC components, especially from Mcm2-7. Active DNA replication is known to correlate with active transcription. Indeed, strong pre-RC assembly preferentially occurred at sites of active transcriptional regulation, presumably determined by chromatin accessibility. Strong Mcm2-7 binding thereby fluctuated cell cycle-dependently, arguing for Mcm2-7 translocations during G1, possibly depending on the active transcriptional machinery. These results indicate ORC and Mcm2-7 positions being mainly dependent on chromatin accessibility in active chromatin, with Mcm2-7 being the major determinant of replication initiation. In heterochromatin, ORC was enriched at H4K20me3 sites, while Mcm2-7 enrichment was less prominent. Employing a plasmid-based replication system, ORC association to H4K20me3 was proven to promote successful pre-RC assembly and replication initiation, situating direct ORC-chromatin interactions being the major determinant for DNA replication regulation in heterochromatin. Taken together, this study proposes two different modes of pre-RC assembly regulation depending on chromatin environment.