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Cytosolic and mitochondrial Ca2+ handling in pulmonary arterial smooth muscle and endothelial cells
Cytosolic and mitochondrial Ca2+ handling in pulmonary arterial smooth muscle and endothelial cells
Cytosolic Ca2+ elevated by receptor-operated (ROCE) or store operated Ca2+ entry (SOCE) and buffered by mitochondrial Ca2+ uptake plays an essential role in physiological processes of lung cells. Disturbed Ca2+ homeostasis in precapillary pulmonary arterial smooth muscle cells (PPASMC) induces pulmonary arterial hypertension (PAH) or disrupts barrier function of murine pulmonary microvascular endothelial cells (MPMVEC) resulting in vascular leakage and lung edema. While SOCE is mediated by stromal interaction molecule (STIM1 and 2) dimers sensing Ca2+ in Ca2+ stores and plasma membrane Orai channels, ROCE is mediated by classical transient receptor potential (TRPC) channels via diacylglycerol (DAG) and receptor-activated phospholipase C (PLC). To investigate if TRPCs are also involved in SOCE, Ca2+ entry was analyzed in PPASMCs isolated from STIM1/2flox/flox/TRPC1/3/6-/- mice as well as control mice and infected with Cre-recombinase expressing lentiviruses to delete STIM1/2 protein expression. Deficiency of STIM1/2 did only impair the long-lasting receptor-operated Ca2+ entry (ROCE), but TRPC1, TRPC3 and TRPC6 channels may be activated indirectly by store-operated Ca2+ entry (SOCE). Lack of STIM1/2 or Orai1 in MPMVECs did not impair acetylcholine-induced vasodilatation of isolated aortic rings but pulmonary microvascular endothelial cells (MPMVECS) isolated from endothelial cell-specific STIM1/2 or Orai1 knockout mice (STIM1/2ΔEC and Orai1ΔEC) were protected from Ca2+-dependent nuclear factor of activated T-cells c3 (NFATc3) nuclear translocation which is involved in expression of proinflammatory mediators highlighting their important role in inflammation processes. Migration and proliferation of MPMVECs was reduced in STIM1/2ΔEC and Orai1ΔEC. Disturbed mitochondrial Ca2+ uptake results in endothelial dysfunction and may affect energy production. The influence of mitochondrial Ca2+ uniporter (MCU) and mitochondrial Ca2+ uniporter regulator 1 (MCUR1) on mitochondrial bioenergetics was investigated in MPMVECs from respective endothelial cell-specific knockout mice. Mitochondrial membrane potential and oxygen consumption rate was not impaired in MCUR1ΔEC or MCUΔEC. ATP production was reduced in MCUR1ΔEC and MCUΔEC. Probably resulting from reduced ATP levels, uncoupling protein 2 (UCP2) was upregulated in MCUR1ΔEC. The upregulated UCP2 might flux protons to prevent mitochondrial membrane potential (ΔΨm) hyperpolarization, induce a metabolic shift from oxidative phosphorylation to glycolysis or stimulate compensatory mechanisms to rescue [Ca2+]m-uptake. In accordance with lower superoxide production in MCUR1ΔEC and MCUΔEC, we observed a reduced proliferation and migration in these cells. Low mitochondrial Ca2+ uptake and low cellular ATP levels in MCUR1ΔEC and MCUΔEC activated AMPK and turned on autophagy. Therefore, cytosolic and mitochondrial Ca2+ handling is of foremost importance for lung cell function and proteins involved in these processes may serve as pharmacological targets for therapeutic approaches in patients with pulmonary hypertension or lung edema., Ca2+ gelangt durch einen Rezeptor-operierten (receptor-operated Ca2+ entry (ROCE))oder Speicher-operierten Einstrom (store-operated Ca2+ entry (SOCE)) ins Zytosol und wird dort durch die mitochondriale Ca2+ Aufnahme abgepuffert. Gestörte Ca2+ Homöostase in prekapillären, pulmonalen, arteriellen glatten Muskelzellen (PPASMC) kann pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) induzieren oder die Barrierefunktion muriner, pulmonaler, mikrovaskulärer Endothelzellen (MPMVEC) vermindern und die Bildung eines Lungenödems induzieren. Während der Speicher-operierte Ca2+ Einstrom durch stromal interaction molecules (STIM1 und 2) als Sensoren in den Ca2+ Speichern und plasmamembranären Orai-Kanälen bewältigt wird, kann der Rezeptor-operierte Ca2+ Einstrom (receptor-operated Ca2+ entry (ROCE)) durch classical transient receptor potential (TRPC) Kanäle über Diacylglycerol (DAG) durch Rezeptor-aktivierte Phospholipasen C (PLC) erfolgen. Um zu analysieren ob TRPCs am SOCE beteiligt sind, haben wir den Ca2+ Einstrom in TRPC1/3/6-/- und STIM1/2-defizienten Zellen, die durch Infektion von STIM1/2flox/flox Zellen mit Cre Rekombinase exprimierenden Lentiviren erzeugt wird,untersucht. Die Abwesenheit von STIM1/2 Protein hatte nur einen Einfluss auf den lang-anhaltenden Rezeptor-operierten Ca2+ Einstrom, aber TRPC1-, TRPC3- und TRPC6-Kanäle könnten durch den Speicher-operierten Ca2+ Einstrom indirekt aktiviert werden. Eine Acetylcholin-induzierte Vasodilatation in isolierten Aortenringen aus endothelzellspezifischen STIM1/2 und Orai1 defizienten Mäusen (STIM1/2ΔEC and Orai1ΔEC) war im Vergleich zu Kontroll-Aortenringen unverändert. Jedoch zeigten MPMVECs aus diesen Mäusen eine verringerte Translokation von nuclear factor of activated T cells c3 (NFATc3) in den Zellkern, die für eine Expression von proinflammatorischen Mediatoren wichtig ist. Die Migration und Proliferation von MPMVECs war in STIM1/2ΔEC and Orai1ΔEC verringert. Eine gestörte mitochondriale Ca2+ Aufnahme resultiert in einer endothelialen Dysfunktion und könnte die Energieproduktion beeinträchtigen. Deshalb wurde der Einfluss des mitochondrialen Ca2+ Uniporters (MCU) und des mitochondrialen Ca2+ Uniporter Regulators1 (MCUR1) auf die mitochondriale Energieproduktion in MPMVECs aus endothelzell-spezifischen MCU- und MCUR1-defizienten Mäusen (MCUR1ΔEC und MCUΔEC) untersucht. Das mitochondriale Membranpotential und die Sauerstoff Verbrauchsrate war in MCUR1ΔEC or MCUΔEC nicht beeinträchtigt, aber die ATP Produktion war vermindert. Wahrscheinlich resultierte aus der verminderten ATP Produktion die vermehrte Produktion des Entkopplungproteins UCP2 in MCUR1ΔEC. Die Hochregulation von UCP2 könnte einen Protonentransport in die mitochondriale Matrix ermöglichen und damit eine Hyperpolarisation des mitochondrialen Membranpotentials der der inneren mitochondrialen Membran verhindern. Alternativ könnte die vermehrte UCP2-Expression zu metabolischen Veränderungen führen oder kompensatorische Mechanismen zur mitochondrialen Ca2+-Aufnahme stimulieren. Niedrige Superoxid Level in MCUR1ΔEC or MCUΔEC bedingten eine verringerte Proliferation und Migration. Außerdem aktivierte die niedrige mitochondriale Ca2+ und die niedrigen ATP Spiegel in MCUR1ΔEC or MCUΔEC die AMPK und Autophagie. Aus diesem Grund kommt der zytosolischen und mitochondrialen Aufnahme von Ca2+ Ionen eine elementare Rolle für die Funktion von pulmonalen glatten Muskelzellen und Endothelzellen zu. In Zukunft könnten an diesen Prozessen beteiligte Proteine als pharmakologische Zielsubstanzen zur Entwicklung von Medikamenten gegen pulmonale Hypertonie und Lungenödemen dienen.
calcium, store-operated, STIM, TRPC, MCUR1
Stickel, Diana
2017
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Stickel, Diana (2017): Cytosolic and mitochondrial Ca2+ handling in pulmonary arterial smooth muscle and endothelial cells. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Cytosolic Ca2+ elevated by receptor-operated (ROCE) or store operated Ca2+ entry (SOCE) and buffered by mitochondrial Ca2+ uptake plays an essential role in physiological processes of lung cells. Disturbed Ca2+ homeostasis in precapillary pulmonary arterial smooth muscle cells (PPASMC) induces pulmonary arterial hypertension (PAH) or disrupts barrier function of murine pulmonary microvascular endothelial cells (MPMVEC) resulting in vascular leakage and lung edema. While SOCE is mediated by stromal interaction molecule (STIM1 and 2) dimers sensing Ca2+ in Ca2+ stores and plasma membrane Orai channels, ROCE is mediated by classical transient receptor potential (TRPC) channels via diacylglycerol (DAG) and receptor-activated phospholipase C (PLC). To investigate if TRPCs are also involved in SOCE, Ca2+ entry was analyzed in PPASMCs isolated from STIM1/2flox/flox/TRPC1/3/6-/- mice as well as control mice and infected with Cre-recombinase expressing lentiviruses to delete STIM1/2 protein expression. Deficiency of STIM1/2 did only impair the long-lasting receptor-operated Ca2+ entry (ROCE), but TRPC1, TRPC3 and TRPC6 channels may be activated indirectly by store-operated Ca2+ entry (SOCE). Lack of STIM1/2 or Orai1 in MPMVECs did not impair acetylcholine-induced vasodilatation of isolated aortic rings but pulmonary microvascular endothelial cells (MPMVECS) isolated from endothelial cell-specific STIM1/2 or Orai1 knockout mice (STIM1/2ΔEC and Orai1ΔEC) were protected from Ca2+-dependent nuclear factor of activated T-cells c3 (NFATc3) nuclear translocation which is involved in expression of proinflammatory mediators highlighting their important role in inflammation processes. Migration and proliferation of MPMVECs was reduced in STIM1/2ΔEC and Orai1ΔEC. Disturbed mitochondrial Ca2+ uptake results in endothelial dysfunction and may affect energy production. The influence of mitochondrial Ca2+ uniporter (MCU) and mitochondrial Ca2+ uniporter regulator 1 (MCUR1) on mitochondrial bioenergetics was investigated in MPMVECs from respective endothelial cell-specific knockout mice. Mitochondrial membrane potential and oxygen consumption rate was not impaired in MCUR1ΔEC or MCUΔEC. ATP production was reduced in MCUR1ΔEC and MCUΔEC. Probably resulting from reduced ATP levels, uncoupling protein 2 (UCP2) was upregulated in MCUR1ΔEC. The upregulated UCP2 might flux protons to prevent mitochondrial membrane potential (ΔΨm) hyperpolarization, induce a metabolic shift from oxidative phosphorylation to glycolysis or stimulate compensatory mechanisms to rescue [Ca2+]m-uptake. In accordance with lower superoxide production in MCUR1ΔEC and MCUΔEC, we observed a reduced proliferation and migration in these cells. Low mitochondrial Ca2+ uptake and low cellular ATP levels in MCUR1ΔEC and MCUΔEC activated AMPK and turned on autophagy. Therefore, cytosolic and mitochondrial Ca2+ handling is of foremost importance for lung cell function and proteins involved in these processes may serve as pharmacological targets for therapeutic approaches in patients with pulmonary hypertension or lung edema.

Abstract

Ca2+ gelangt durch einen Rezeptor-operierten (receptor-operated Ca2+ entry (ROCE))oder Speicher-operierten Einstrom (store-operated Ca2+ entry (SOCE)) ins Zytosol und wird dort durch die mitochondriale Ca2+ Aufnahme abgepuffert. Gestörte Ca2+ Homöostase in prekapillären, pulmonalen, arteriellen glatten Muskelzellen (PPASMC) kann pulmonale arterielle Hypertonie (PAH) induzieren oder die Barrierefunktion muriner, pulmonaler, mikrovaskulärer Endothelzellen (MPMVEC) vermindern und die Bildung eines Lungenödems induzieren. Während der Speicher-operierte Ca2+ Einstrom durch stromal interaction molecules (STIM1 und 2) als Sensoren in den Ca2+ Speichern und plasmamembranären Orai-Kanälen bewältigt wird, kann der Rezeptor-operierte Ca2+ Einstrom (receptor-operated Ca2+ entry (ROCE)) durch classical transient receptor potential (TRPC) Kanäle über Diacylglycerol (DAG) durch Rezeptor-aktivierte Phospholipasen C (PLC) erfolgen. Um zu analysieren ob TRPCs am SOCE beteiligt sind, haben wir den Ca2+ Einstrom in TRPC1/3/6-/- und STIM1/2-defizienten Zellen, die durch Infektion von STIM1/2flox/flox Zellen mit Cre Rekombinase exprimierenden Lentiviren erzeugt wird,untersucht. Die Abwesenheit von STIM1/2 Protein hatte nur einen Einfluss auf den lang-anhaltenden Rezeptor-operierten Ca2+ Einstrom, aber TRPC1-, TRPC3- und TRPC6-Kanäle könnten durch den Speicher-operierten Ca2+ Einstrom indirekt aktiviert werden. Eine Acetylcholin-induzierte Vasodilatation in isolierten Aortenringen aus endothelzellspezifischen STIM1/2 und Orai1 defizienten Mäusen (STIM1/2ΔEC and Orai1ΔEC) war im Vergleich zu Kontroll-Aortenringen unverändert. Jedoch zeigten MPMVECs aus diesen Mäusen eine verringerte Translokation von nuclear factor of activated T cells c3 (NFATc3) in den Zellkern, die für eine Expression von proinflammatorischen Mediatoren wichtig ist. Die Migration und Proliferation von MPMVECs war in STIM1/2ΔEC and Orai1ΔEC verringert. Eine gestörte mitochondriale Ca2+ Aufnahme resultiert in einer endothelialen Dysfunktion und könnte die Energieproduktion beeinträchtigen. Deshalb wurde der Einfluss des mitochondrialen Ca2+ Uniporters (MCU) und des mitochondrialen Ca2+ Uniporter Regulators1 (MCUR1) auf die mitochondriale Energieproduktion in MPMVECs aus endothelzell-spezifischen MCU- und MCUR1-defizienten Mäusen (MCUR1ΔEC und MCUΔEC) untersucht. Das mitochondriale Membranpotential und die Sauerstoff Verbrauchsrate war in MCUR1ΔEC or MCUΔEC nicht beeinträchtigt, aber die ATP Produktion war vermindert. Wahrscheinlich resultierte aus der verminderten ATP Produktion die vermehrte Produktion des Entkopplungproteins UCP2 in MCUR1ΔEC. Die Hochregulation von UCP2 könnte einen Protonentransport in die mitochondriale Matrix ermöglichen und damit eine Hyperpolarisation des mitochondrialen Membranpotentials der der inneren mitochondrialen Membran verhindern. Alternativ könnte die vermehrte UCP2-Expression zu metabolischen Veränderungen führen oder kompensatorische Mechanismen zur mitochondrialen Ca2+-Aufnahme stimulieren. Niedrige Superoxid Level in MCUR1ΔEC or MCUΔEC bedingten eine verringerte Proliferation und Migration. Außerdem aktivierte die niedrige mitochondriale Ca2+ und die niedrigen ATP Spiegel in MCUR1ΔEC or MCUΔEC die AMPK und Autophagie. Aus diesem Grund kommt der zytosolischen und mitochondrialen Aufnahme von Ca2+ Ionen eine elementare Rolle für die Funktion von pulmonalen glatten Muskelzellen und Endothelzellen zu. In Zukunft könnten an diesen Prozessen beteiligte Proteine als pharmakologische Zielsubstanzen zur Entwicklung von Medikamenten gegen pulmonale Hypertonie und Lungenödemen dienen.