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Patients' acute lymphoblastic leukemia cells show heterogeneous growth behavior and drug sensitivity in vivo
Patients' acute lymphoblastic leukemia cells show heterogeneous growth behavior and drug sensitivity in vivo
Acute leukemias consist of heterogeneous cell populations and the most aggressive subpopulation determines prognosis and outcome in each patient. A better understanding of challenging subclones is intensively desired, regarding both genotype and functional phenotype. New therapies are required which eradicate aggressive subpopulations in order to improve the prognosis and cure rate of patients with cancer. Here, we aimed at characterizing single cell clones in order to find putative therapeutic targets. Primary tumor cells from a girl with acute lymphoblastic leukemia (ALL) at first relapse were transplanted into severely immunocompromised mice and lentivirally modified to express the fluorochromes red, green and blue at different amounts and combinations (RGB marking, (Weber et al., 2011)). Single cell clones were generated by limiting dilution transplantation and their uniqueness was verified by LM-PCR. In order to identify challenging subclones, molecularly marked clone mixtures were transplanted into the same recipient mouse to perform competitive in vivo proliferation and drug sensitivity assays and analyzed separately by flow cytometry using their unique expression of molecular markers. In clone mixtures, certain clones were overgrown by others indicating unfavorable slow proliferation. When two clones were mixed and transplanted in groups of mice and animals were treated with glucocorticoids, one clone showed significantly reduced sensitivity against in vivo glucocorticoid treatment which was accompanied by slow growth, identifying this clone as especially aggressive and challenging for treatment. Taken together, the present work established a novel approach to characterize challenging subclones regarding functional features and genetic characteristics which will help to develop efficient novel treatment approaches to eliminate aggressive cell clones in the future., Akute Leukämien bestehen aus heterogenen Zellpopulationen, die sich sowohl in genetischen als auch in funktionellen Eigenschaften unterscheiden können. Letztendlich ist die jeweils aggressivste Subpopulation eines Tumors entscheidend für die Prognose und den Krankheitsverlauf des Patienten. Ein besseres Verständnis von aggressiven Subklonen sowohl bezüglich Genotyp als auch funktionellem Phänotyp ist erforderlich, um neue Angriffspunkte für Chemotherapeutika zu finden und so die Prognose und Heilungsrate von Krebspatienten zu verbessern. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Einzelzellklone zu charakterisieren, um neue therapeutische Targets zu identifizieren. Dafür wurden primäre Tumorzellen von einem Mädchen mit akuter lymphatischer Leukämie (ALL) im ersten Rezidiv in immunsupprimierte Mäuse transplantiert und mit Lentiviren genetisch so modifiziert, dass sie ein rotes, ein grünes und ein blaues Fluoreszenzprotein in verschiedenen Mengen und Kombinationen exprimierten (RGB marking, (Weber et al., 2011)). Im Anschluss wurden Einzelzellklone der Leukämieprobe hergestellt, indem wenige RGB-gefärbte Xenograftzellen in Mäuse transplantiert wurden und dadurch individuell gefärbt Einzelzellen amplifiziert wurden. Die Identität der Zellen der Einzelzellklone wurde mittels LM-PCR bestätigt. Um aggressive Subklone aufzuspüren, wurden verschiedene Klone gemischt, zusammen in Mäuse transplantiert und in vivo Proliferationsassays und Chemoresistenzassays durchgeführt. Dabei konnten die Klone mittels Durchflusszytometrie anhand ihrer unterschiedlichen molekularen Farbmarkierungen klar voneinander unterschieden werden. Bei gemeinsamer Transplantation von Mischungen von verschiedenen Klonen zusammen in eine Maus wurden einige Klone von anderen überwachsen, was auf ein aggressives, langsames Wachstumsverhalten der überwachsenen Klone schließen lässt. Außerdem wurden zwei Klone gemeinsam in Mäuse transplantiert und diese Mäuse mit Glucocorticoiden behandelt. Dabei wies ein Klon eine erheblich geringere Sensitivität gegenüber in vivo Glucocorticoid-Behandlung in Kombination mit einem langsamen Wachstumsverhalten auf, was diesen Klon als besonders aggressiv und schwer zu behandeln identifizierte. Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit eine neue Methode etabliert, um aggressive Subklone sowohl hinsichtlich funktioneller Besonderheiten als auch bezüglich genetischer Merkmale zu charakterisieren, was helfen wird, neue effiziente Behandlungsmethoden zu entwickeln, um aggressive Subklone in Zukunft besser eliminieren zu können.
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Finkenzeller, Cornelia
2016
English
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Finkenzeller, Cornelia (2016): Patients' acute lymphoblastic leukemia cells show heterogeneous growth behavior and drug sensitivity in vivo. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Acute leukemias consist of heterogeneous cell populations and the most aggressive subpopulation determines prognosis and outcome in each patient. A better understanding of challenging subclones is intensively desired, regarding both genotype and functional phenotype. New therapies are required which eradicate aggressive subpopulations in order to improve the prognosis and cure rate of patients with cancer. Here, we aimed at characterizing single cell clones in order to find putative therapeutic targets. Primary tumor cells from a girl with acute lymphoblastic leukemia (ALL) at first relapse were transplanted into severely immunocompromised mice and lentivirally modified to express the fluorochromes red, green and blue at different amounts and combinations (RGB marking, (Weber et al., 2011)). Single cell clones were generated by limiting dilution transplantation and their uniqueness was verified by LM-PCR. In order to identify challenging subclones, molecularly marked clone mixtures were transplanted into the same recipient mouse to perform competitive in vivo proliferation and drug sensitivity assays and analyzed separately by flow cytometry using their unique expression of molecular markers. In clone mixtures, certain clones were overgrown by others indicating unfavorable slow proliferation. When two clones were mixed and transplanted in groups of mice and animals were treated with glucocorticoids, one clone showed significantly reduced sensitivity against in vivo glucocorticoid treatment which was accompanied by slow growth, identifying this clone as especially aggressive and challenging for treatment. Taken together, the present work established a novel approach to characterize challenging subclones regarding functional features and genetic characteristics which will help to develop efficient novel treatment approaches to eliminate aggressive cell clones in the future.

Abstract

Akute Leukämien bestehen aus heterogenen Zellpopulationen, die sich sowohl in genetischen als auch in funktionellen Eigenschaften unterscheiden können. Letztendlich ist die jeweils aggressivste Subpopulation eines Tumors entscheidend für die Prognose und den Krankheitsverlauf des Patienten. Ein besseres Verständnis von aggressiven Subklonen sowohl bezüglich Genotyp als auch funktionellem Phänotyp ist erforderlich, um neue Angriffspunkte für Chemotherapeutika zu finden und so die Prognose und Heilungsrate von Krebspatienten zu verbessern. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Einzelzellklone zu charakterisieren, um neue therapeutische Targets zu identifizieren. Dafür wurden primäre Tumorzellen von einem Mädchen mit akuter lymphatischer Leukämie (ALL) im ersten Rezidiv in immunsupprimierte Mäuse transplantiert und mit Lentiviren genetisch so modifiziert, dass sie ein rotes, ein grünes und ein blaues Fluoreszenzprotein in verschiedenen Mengen und Kombinationen exprimierten (RGB marking, (Weber et al., 2011)). Im Anschluss wurden Einzelzellklone der Leukämieprobe hergestellt, indem wenige RGB-gefärbte Xenograftzellen in Mäuse transplantiert wurden und dadurch individuell gefärbt Einzelzellen amplifiziert wurden. Die Identität der Zellen der Einzelzellklone wurde mittels LM-PCR bestätigt. Um aggressive Subklone aufzuspüren, wurden verschiedene Klone gemischt, zusammen in Mäuse transplantiert und in vivo Proliferationsassays und Chemoresistenzassays durchgeführt. Dabei konnten die Klone mittels Durchflusszytometrie anhand ihrer unterschiedlichen molekularen Farbmarkierungen klar voneinander unterschieden werden. Bei gemeinsamer Transplantation von Mischungen von verschiedenen Klonen zusammen in eine Maus wurden einige Klone von anderen überwachsen, was auf ein aggressives, langsames Wachstumsverhalten der überwachsenen Klone schließen lässt. Außerdem wurden zwei Klone gemeinsam in Mäuse transplantiert und diese Mäuse mit Glucocorticoiden behandelt. Dabei wies ein Klon eine erheblich geringere Sensitivität gegenüber in vivo Glucocorticoid-Behandlung in Kombination mit einem langsamen Wachstumsverhalten auf, was diesen Klon als besonders aggressiv und schwer zu behandeln identifizierte. Zusammenfassend wurde in der vorliegenden Arbeit eine neue Methode etabliert, um aggressive Subklone sowohl hinsichtlich funktioneller Besonderheiten als auch bezüglich genetischer Merkmale zu charakterisieren, was helfen wird, neue effiziente Behandlungsmethoden zu entwickeln, um aggressive Subklone in Zukunft besser eliminieren zu können.