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Kyratsous, Nikolaos (2016): Calcium signals in encephalitogenic T cells on their way into central nervous system tissues: an in vivo imaging study. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Multiple Sclerosis (MS) is an autoimmune disease, which features a highly complex pathogenic cascade and involves the infiltration of mononuclear cells into the brain and spinal cord. Although many essential steps in the development of the disease remain ambiguous, experimental and clinical studies indicate that autoreactive CD4+ helper T cells are crucial for induction of inflammation in the central nervous system (CNS). By using Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) as an animal model for MS, it was previously shown that encephalitogenic T cells mature in peripheral organs. Next, T cells migrate to the CNS, become activated, and initiate inflammation. During their sojourn, the T cells perceive stimuli and respond to their microenvironment through signal transduction mechanisms. To portray the serial signaling in transfer EAE (tEAE), two activation reporters, a FRET-based calcium biosensor and a fluorescent NFAT activation marker were combined with in situ two-photon microscopy. The Twitch calcium sensor can detect weak signals which are accumulated within the cells and lead to T cell activation. On the other hand, NFAT sensor can reliably detect T cell activation induced by antigen recognition in vivo. During T cell maturation in the spleen, both myelin basic protein (MBP) specific encephalitogenic and OVA specific control T cells displayed similarly low frequent and short-lasting calcium signaling. This process was driven by chemokine and MHC class II-dependent signals. Next, arrived at leptomeningeal blood vessels, the portal to the spinal cord, intravascular T cells presented minimal calcium activity. Short-lasting calcium signaling was detected only during rolling-crawling transitions. After extravasation, in spinal cord leptomeningeal space and parenchyma, the T cells responded with high, sustained calcium plateaus, and NFAT translocation. T cells presented longer-lasting elevated calcium levels (>2 min) after contacting local antigen presenting (APC) cells, whereas OVA specific T cells presented only short calcium spikes. Each APC displayed different potential to stimulate T cells likely due to the limited availability of immunogenic myelin proteins. This T cell reaction was most pronounced in the prodromal phase, and followed a ‘first come – first served’ rule for antigen recognition. When MHC class II was blocked by intrathecal injection of blocking antibody, MBP specific T cells presented only short-lasting calcium signaling similar to those in the spleen. Accordingly the treatment reduced the infiltration of T cells and clinical severity. To directly correlate the activation of encephalitogenic T cells with their calcium signaling, a new combined sensor was generated. The co-expression of Twitch and ∆NFAT protein required a set of fluorescent proteins (FP) that would have minimal bleed through in their emission channels. Five FPs were evaluated, and mRuby2 was selected as the red analogous counterpart of ∆NFAT-GFP. In combination with Twitch, ∆NFAT-mRuby2 displayed similar translocation kinetics compared to ∆NFAT-GFP and presented adequate two-photon absorption. Nonetheless, more detailed studies need to be performed regarding the dual sensors‘ transduction efficiency.

Abstract

Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunerkrankung mit einer hochkomplexen pathogenen Kaskade, die mit der Infiltration mononuklearer Zellen in das Gehirn und das Rückenmark einhergeht. Wenngleich viele essentielle Schritte in Krankheitsausbruch und verlauf noch ungeklärt sind, offenbarten experimentelle und klinische Studien, dass autoreaktive CD4+-T-Helferzellen für die Induktion der Entzündung im zentralen Nervensystem eine wesentliche Rolle spielen. Mithilfe der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) als Tiermodell für MS konnte gezeigt werden, dass enzephalitogene T-Zellen in der Peripherie heranreifen, bevor sie in das ZNS einwandern, dort aktiviert werden und Entzündungen auslösen. Während ihres Aufenthalts erhalten die T-Zellen Stimuli und reagieren über Signaltransduktionsmechanismen auf ihre Mikroumgebung. Um die seriellen Signalwege in adoptiv transferierter EAE darstellen zu können, wurden zwei Aktivierungsreporter mit in situ Zwei-Photonen-Mikroskopie kombiniert: Twitch, ein FRET-basierter Calcium-Biosensor, und mit einem Fluorophor markiertes NFAT. Twitch ist in der Lage, schwache Signale zu detektieren, die in den Zellen akkumulieren und zur T-Zell-Aktivierung führen. Das mit einem Fluorophor markierte NFAT hingegen macht durch in vivo Antigenerkennung ausgelöste T-Zell-Aktivierung sichtbar. Während der T-Zellreifung in der Milz zeigten sowohl die für das Myelin-basische Protein (MBP) als auch die als Kontrolle dienenden für Ovalbumin (OVA) spezifischen T-Zellen wenige und kurze Calcium-Signale. Dieser Prozess wird von Chemokin- und MHCII-abhängigen Signalen gesteuert. Im nächsten Schritt - in den leptomeningealen Blutgefäßen, die für T-Zellen das Tor zum Rückenmark darstellen - wiesen intravaskuläre T-Zellen eine minimale Calcium-Aktivität auf. Kurze Calcium-Signale wurden nur während des Übergangs vom Rollen zum Kriechen der T-Zellen an der Blutgefäßwand detektiert. Nach der Extravasation in den leptomeningealen Raum und das Rückenmarksparenchym reagierten die T-Zellen mit konstant hohen Calcium-Levels und NFAT-Translokation. Die MBP-spezifischen T-Zellen zeigten eine langanhaltende Erhöhung des Calciumspiegels (>2 min) nach dem Kontakt mit lokalen Antigen-präsentierenden Zellen, wohingegen in OVA-spezifische T-Zellen nur kurze Calcium-Spikes ausgelöst wurden. Die Antigen-präsentierenden Zellen hatten unterschiedlich starke Effekte auf die T-Zell-Stimulation, vermutlich aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit immunogener Myelinproteine. Diese Reaktion der T-Zellen war in der Prodromalphase am stärksten ausgeprägt und folgte in Bezug auf die Antigenerkennung dem Prinzip „wer zuerst kommt, mahlt zuerst“. Bei Blockierung der MHCII-Moleküle durch intrathekale Injektion blockierender Antikörper wiesen MBP-spezifische T-Zellen nur einen kurzen Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration auf, vergleichbar mit den Calciumsignalen während der Reifung in der Milz. Dementsprechend minderte diese Behandlung die Infiltration von T-Zellen in das ZNS und somit den Schweregrad der klinischen Symptome. Für die direkte Korrelierung der Aktivierung der enzephalitogenen T-Zellen mit deren Calciumsignalen wurde ein kombinierter Sensor entwickelt. Die Co-Expression von Twitch und dem ∆NFAT-Protein erforderte eine Zusammenstellung von Fluoreszenzproteinen mit minimalem Bleedthrough in die jeweils anderen Emissionswellenlängen. Fünf Fluoreszenzproteine wurden getestet und mRuby2 wurde als im roten Wellenlängenbereich emittierendes Pendant zu ∆NFAT-GFP ausgewählt. In Verbindung mit Twitch wies ∆NFAT-mRuby2 eine ähnliche Translokationskinetik wie ∆NFAT-GFP mit geeigneter Zwei-Photonen-Absorption auf. Nichtsdestotrotz sind detailliertere Untersuchungen nötig, um die Transduktionseffizienz des Doppelsensors vollständig zu bestimmen.