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Kammerl, Ilona (2016): Proteasome and immunoproteasome function in cigarette smoke-mediated chronic lung disease. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is projected to be the third leading cause of death by 2020 with cigarette smoke exposure being the main risk factor. Cigarette smoke leads to oxidative stress in the lung, resulting in protein damage and adaptive immune responses. Also, smokers and COPD patients are more susceptible to viral infections often followed by acute exacerbations of COPD pathogenesis. Lungs of COPD patients exhibit increased numbers of innate and adaptive immune cells, among these CD8+ T cells, whose abundance correlates with disease severity. The proteasome degrades more than 90 % of intracellular proteins - including damaged ones - into small peptides and is important to protect the cell from proteotoxic stress. Furthermore, the immunoproteasome, a specialized proteasome subtype which is expressed by default in antigen presenting cells and induced during infection, is involved in shaping adaptive immune responses by enhancing antigen presentation via major histocompatibility complex (MHC) I to cytotoxic CD8+ T cells. The effects of cigarette smoke on (immuno-)proteasome function have not been investigated so far. The first publication included in this thesis (van Rijt et al. 2012) explored the effects of acute cigarette smoke exposure on proteasome expression and activity. We observed that short-term exposure of cells to extracts of cigarette smoke directly impaired proteasome activity, while proteasomal protein expression was not altered. Oxidatively modified and polyubiquitinated proteins accumulated, suggesting augmentation of oxidative stress in cigarette smoke-treated cells. In lungs of mice acutely exposed to cigarette smoke, a similar effect could be observed: one of the three proteasome activities was significantly reduced, and ubiquitinated substrates for the proteasome were found to be accumulated, while proteasome expression levels were not changed. The second publication in this thesis (Keller et al. 2015) shows for the first time the cell-specific expression of immunoproteasomes in the lung and their induction by interferon-γ in vitro and by murid herpesvirus 68 (MHV-68) infection in vivo. Within these experiments, activity-based probes were used to clearly define the kinetics of standard and immunoproteasome subunit incorporation. In human lungs from controls or early-stage COPD patients, immunoproteasome expression was not changed. Immunoproteasomes localized mainly to alveolar macrophages, but not to parenchymal cells in both donors and end-stage COPD. Results from recent experiments were accepted for publication in the meantime (Kammerl et al. 2016): we investigated MHC I antigen presentation in cigarette smoke extract-treated primary immune cells and bronchoalveolar lavage (BAL) cells from mice exposed to cigarette smoke for ten days. In vitro treatment of primary immune cells with cigarette smoke extract led to a decrease in the presentation of an immunoproteasome-dependent “self”-epitope. With the help of activity-based probes, we observed a shift from immuno- to standard proteasome activity in isolated alveolar macrophages from smoke exposed mice. This shift, however, was not sufficient to impact antigen presentation of an immunoproteasome-dependent epitope. The altered ratio of standard and immunoproteasome might be explained by transcriptional downregulation of immuno-, but not standard proteasomes by cigarette smoke in isolated alveolar macrophages of smoke-exposed mice, which was also observed in total BAL cells of early-stage COPD patients. In the lungs of end-stage COPD patients, activities of both standard and immunoproteasome subunits were significantly decreased, while total proteasome protein levels were not changed. Taken together, we show that cigarette smoke directly impairs proteasome function in vitro and in vivo, which may exacerbate oxidative stress resolution in response to cigarette smoke, since the degradation of oxidatively modified and misfolded proteins is impaired. In addition, we observed alterations in immunoproteasome-dependent MHC I antigen presentation, which may contribute to increased susceptibility to virus-induced exacerbations, prolonged infection and possibly result in autoimmune responses.

Abstract

Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (chronic obstructive pulmonary disease, COPD) wird laut Hochrechnungen die weltweit dritthäufigste Todesursache im Jahr 2020 darstellen. Zigarettenkonsum gilt als Hauptrisikofaktor für die Entstehung der COPD. Das Rauchen von Zigaretten führt in der Lunge zu oxidativem Stress, welcher zu Beschädigung von Proteinen und Induktion einer adaptiven Immunantwort führt. Raucher und COPD-Patienten sind außerdem anfälliger für Virusinfektionen, die oft in einer akuten Exazerbation der COPD-Pathogenese resultieren. Die Lungen von COPD-Patienten weisen hierbei eine erhöhte Anzahl an Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems auf, darunter befinden sich auch CD8+ T-Zellen, deren Häufigkeit mit dem Krankheitsstadium korreliert. Das Proteasom baut mehr als 90 % aller intrazellulären, einschließlich beschädigter Proteine zu kurzen Peptiden ab und schützt die Zelle so vor proteotoxischem Stress. Das Immunproteasom stellt eine besondere Proteasomform dar und ist in antigenpräsentierenden Zellen ständig exprimiert oder kann durch Infektion induziert werden. Es ist weiterhin maßgeblicher Bestandteil der adaptiven Immunantwort, da es die Antigenpräsentation über den Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex, MHC) Klasse I zu CD8+ T-Zellen verbessert. Der Effekt von Zigarettenrauch auf die Funktion des (Immun-)Proteasoms wurde noch nicht untersucht. Die erste Veröffentlichung in dieser Dissertation (van Rijt et al. 2012) untersuchte die akuten Effekte der Zigarettenrauch-Exposition auf Proteasomexpression und -aktivität. Dabei konnten wir beobachten, dass kurzzeitige Exposition gegenüber Zigarettenrauch die Proteasomaktivität direkt beeinträchtigte, während sich die Proteasomexpression nicht änderte. Die Anreicherung oxidativ modifizierter und ubiquitinierter Proteine legte eine Verstärkung des oxidativen Stresses in Zellen nahe, die mit Zigarettenrauch behandelt wurden. In Lungen von Mäusen, die akut Zigarettenrauch ausgesetzt waren, wurde ein ähnlicher Effekt beobachtet: Eine der drei Proteasomaktivitäten war signifikant reduziert, während ubiquitinierte Proteasomsubstrate akkumulierten, die Proteasomexpression jedoch unverändert war. Die zweite Veröffentlichung dieser Dissertation (Keller et al. 2015) zeigt erstmals die zellspezifische Expression von Immunproteasomen in der Lunge sowie ihre Induktion durch Interferon-γ in vitro und nach Infektion mit dem murinen Herpesvirus 68 (MHV 68) in vivo. Für diese Untersuchungen wurde von Aktivitäts-basierten Sonden Gebrauch gemacht, um die Kinetik der Inkorporation von Standard- und Immunproteasom-Untereinheiten genau zu beschreiben. In humanen Lungen von Kontrollpersonen oder Patienten mit COPD im Frühstadium wurde keine Änderung der Immunproteasomexpression beobachtet. Außerdem wurden Immunproteasomen hauptsächlich in Alveolarmakrophagen von Organspendern und COPD-Patienten im Endstadium detektiert, jedoch nicht in deren parenchymalen Zellen. Neu erhobene Daten wurden vor kurzem zur Publikation angenommen (Kammerl et al. 2016): Wir untersuchten MHC I Antigenpräsentation in primären Immunzellen, die mit Zigarettenrauchextrakt behandelt wurden, sowie in Bronchoalveolär-lavagierten (BAL)-Zellen, die von Mäusen stammten, welche zehn Tage lang Zigarettenrauch ausgesetzt waren. Die in vitro Behandlung von primären Immunzellen mit Zigarettenrauchextrakt führte zur Verminderung der Präsentation eines Immunproteasom-abhängigen „Selbst“-Epitops. Mit Hilfe von Aktivitäts-basierten Sonden beobachteten wir eine Verschiebung von Immun- zu Standardproteasomaktivität in isolierten Alveolarmakrophagen von berauchten Mäusen. Jedoch war diese Verschiebung nicht ausreichend, um die Antigenpräsentation eines Immunproteasom-abhängigen Epitops zu verändern. Das verschobene Verhältnis von Standard- und Immunproteasom könnte durch die transkriptionelle Herabregulierung der Immunproteasom-Untereinheiten durch Zigarettenrauch in isolierten Alveolarmakrophagen erklärt werden. Die Standardproteasom-Untereinheiten blieben hierbei unverändert. Dieser Effekt wurde auch in BAL-Zellen von COPD-Patienten im Frühstadium beobachtet. Die Lungen von COPD-Patienten im Endstadium wiesen signifikant verminderte Standard- und Immunproteasomaktivitäten auf, während auf Proteineben die Proteasomexpression unverändert war. Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass Zigarettenrauch die Proteasomfunktion in vitro und in vivo direkt beeinträchtigt, was möglicherweise die Beseitigung des Zigarettenrauch-induzierten oxidativen Stresses erschwert, da der Abbau oxidativ-modifizierter und fehlgefalteter Proteine beeinträchtigt ist. Außerdem konnten wir Veränderungen der Immunproteasom-abhängigen MHC I-Antigenpräsentation beobachten, was eventuell zu einer gesteigerten Anfälligkeit für Virus induzierte Exazerbationen, verlängerter Infektionsdauer und zu Autoimmunprozessen führt.