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Philipp, Alexander (2015): Frei zirkulierende methylierte DNA als Tumormarker des kolorektalen Karzinoms. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Ziel der Studien war die Untersuchung der prognostischen Aussagekraft der methylierten Gene HLTF, HPP1 und NEUROG1. Bislang wird eine Prognoseabschätzung hauptsächlich über radiologische und pathologische Kriterien erreicht. Im Blut bestimmte Marker haben den Vorteil einer relativ unaufwändigen, nichtinvasiven Gewinnung und könnten eine wertvolle Ergänzung der etablierten Faktoren darstellen. Als Vergleichsmarker wurde mit dem CEA der einzige für das KRK relevante Tumormarker, für den eine prognostische Wertigkeit beschrieben wurde, gewählt. Anhand der vorliegenden Daten konnte gezeigt werden, dass HLTF- und HPP1-Methylierung am häufigsten im Serum von Patienten mit fortgeschrittenen, insbesondere metastasierten, Erkrankungen zu finden sind und Marker für eine deutlich schlechtere Prognose sind. Dieser hochsignifikante Effekt zeigte sich insbesondere bei den Patienten mit Metastasen, bei denen jeweils eine Subgruppe mit einer deutlich schlechteren Prognose identifiziert werden konnte. Im Vergleich mit CEA zeigten HLTF und HPP1 eine mindestens gleichwertige prognostische Bedeutung im vorliegenden Kollektiv. Auch in der multivariaten Analyse blieben HLTF, HPP1 und CEA als voneinander unabhängige prognostische Faktoren im Stadium IV bestehen, wobei der Vorteil von HLTF und HPP1 darin liegt, dass diese weiter als binäre Parameter verwendet werden können, während für CEA erst ein passender Grenzwert innerhalb der Population definiert werden muss. Das Vorliegen von korrespondierenden Gewebeproben zu den untersuchten Blutproben ermöglichte die erstmalige Untersuchung der Korrelation von Methylierung von HLTF, HPP1 und NEUROG1 in Serum und Primärtumor. Alle positiven Serumproben zeigten bis auf eine Ausnahme auch Methylierung der entsprechenden Gene im Gewebe. Damit konnte diese Untersuchung die angenommene Herkunft der frei zirkulierenden methylierenden DNA aus dem Tumor bestätigen. Ein Zusammenhang mit dem Methylierungsphänotyp CIMP ergab sich im Kollektiv nicht. In einer weiteren Untersuchung wurde der Zusammenhang der drei Zielparameter mit LDH im Blut als Surrogatmarker für einen hohen Zellzerfall untersucht. Die hohe Korrelation von HLTF und HPP1 mit erhöhten LDH-Spiegeln legt den Zerfall der Tumorzellen als möglichen Mechanismus der Freisetzung der Tumor-DNA in die Blutbahn nahe. Auf der anderen Seite bestand kein Zusammenhang von LDH und Methylierung von NEUROG1. Somit müssen neben tumorassoziiertem Zelltod weitere Mechanismen bei der Freisetzung von methylierter Tumor-DNA eine Rolle spielen, die aktuell noch ungeklärt sind. Zusammenfassend wurde frei zirkulierende methylierte HLTF- und HPP1-DNA als unabhängiger prognostischer Marker des metastasierten kolorektalen Karzinoms untersucht und charakterisiert. Diese vielversprechenden Ergebnisse stellen wertvolle Ansatzpunkte für die weitere Erforschung der Marker in Folgestudien dar, um klinische Anwendungsgebiete zu evaluieren, beispielsweise in der prätherapeutischen Risikostratifizierung, im Therapiemonitoring oder auch zur Prädiktion des Ansprechens auf spezifische Tumortherapien.

Abstract

The aim of these studies was to evaluate the prognostic value of methylated genes HLTF, HPP1, and NEUROG1. To date, the assessment of prognosis was typically done via radiological or pathological criteria. The significant advantage of blood-based markers lies in the relatively easy, non-invasive retrieval and could therefore prove a useful addition to the established markers. CEA was chosen as a comparative tumor marker for being, until now, the only one with a proven prognostic relevance for colorectal carcinoma. The conducted measurements demonstrated that methylated DNA of HLTF and HPP1 genes was found more frequently in blood samples of patients with advanced, and specifically, metastasized colorectal cancer (CRC) and is a marker for worse prognosis. This highly significant effect appeared specifically among the group of patients with metastases, within which a subgroup with a notably worse prognosis could be identified. Compared with CEA, the prognostic relevance of HLTF and HPP1 was at least equal in the collective studied. Likewise, in multivariate analysis HLTF, HPP1 and CEA remained independent prognostic factors in stage IV, the advantage of HLTF and HPP1 being that these markers can continue to be used as binary parameters, whereas a suitable cutoff value for CEA within the population needs to be defined first. The availability of tissue samples corresponding to the examined blood samples allowed for the first study of the correlation between methylation of HLTF, HPP1 and NEUROG1 in serum and primary tumor. All positive serum samples, with one exception, also showed methylation of the respective genes in the tissue samples. Hence this study was able to confirm the hypothesized provenance of circulating cell-free methylated DNA from the tumor. An interrelation with methylation phenotype CIMP was not evident in the study population. In a subsequent study the correlation of the three target parameters with LDH in blood as a surrogate marker for cell disintegration was examined. The high correlation of HLTF and HPP1 with elevated LDH levels suggests the decomposition of tumor cells as a possible mechanism by which tumor DNA is released into the bloodstream. On the other hand, no correlation between LDH and methylation of NEUROG1 existed. Therefore mechanisms other than tumor associated cell death have to play a role in the release of methylated tumor DNA, which are unexplained yet. In summary, methylated circulating cell-free HLTF and HPP1 DNA was analyzed and characterized as an independent prognostic marker for metastasized CRC. The promising results provide valuable groundwork for further examination of these markers in subsequent studies in order to evaluate potential clinical use for example in pretherapeutic risk stratification, therapy monitoring or prediction of response to specific tumor therapies.