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Sarker, Rim Sabrina Jahan (2015): Role of CARM1 in regulation of alveolar epithelial senescence and emphysema susceptibility. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by an irreversible loss of lung function and is one of the most prevalent and severe diseases world-wide. A major feature of COPD is emphysema- a long-term, progressive condition. The hallmark of emphysema includes the destruction of alveolar structures leading to enlarged air spaces and reduced surface area. Experimental evidence suggests that emphysema development is driven by accelerated senescence of lung cells but the underlying mechanism of senescence is yet to be fully elucidated. Protein arginine methyltransferases (PRMTs) are important for cellular processes, such as the regulation of senescence, cell proliferation, differentiation and apoptosis. The PRMT family includes 11 members classified as type I, II or III enzymes depending on their methylation pattern (asymmetric dimethylation, symmetric dimethylation or monomethylation, respectively). One member of this family is PRMT4, a type I enzyme, which is also called coactivator associated arginine methyltransferase 1 (CARM1). It was originally identified as a coactivator for steroid hormone receptors. CARM1 is known to methylate histone H3 and various non-histone proteins that play essential roles in transcriptional regulation, RNA splicing, and metabolism. Most importantly, complete loss of CARM1 leads to disrupted differentiation and maturation of alveolar epithelial type-II cells (ATII). Furthermore, CARM1 also plays a role in regulating cellular senescence via CARM1-dependent methylation. Based on these reports, we hypothesized that CARM1 regulates the development and progression of emphysema. To address this, we investigated the contribution of CARM1 to alveolar rarefication using the mouse model of elastase-induced emphysema in vivo and siRNA-mediated knockdown in ATII-like LA4 cells in vitro. We monitored emphysema progression for 161 days in mice treated with a single oropharyngeal application of elastase. The progression was manifested by the decline in lung function parameters. The mean chord length (Lm) confirmed a time dependent airspace enlargement and was directly correlated with a significant increase in dynamic lung compliance. We also observed that at later time points (day 56 and 161), emphysema progression was inflammation-independent. We demonstrated that emphysema advancement was associated with a time-dependent downregulation of CARM1, specifically in alveolar epithelial cells. Furthermore, the global CARM1 activity was also reduced as reflected by an elevated level of CARM1 phosphorylation in the lung. Most importantly, elastase-treated CARM1 haploinsufficient mice showed significantly increased airspace enlargement (52.5±9.6 µm vs. 38.8±5.5 µm, p<0.01) and lung compliance (2.8±0.32 µl/cmH20 vs. 2.4±0.4 µl/cmH20, p<0.04) compared with wild type controls. Reduced CARM1 contributed to senescence of alveolar epithelial cells evident by the reduction of anti-senescence SIRT1 and the induction of senescence markers p16 and β-galactosidase in alveolar epithelial cells. We further demonstrated that CARM1 haploinsufficiency impaired trans-differentiation of ATII into ATI cells. Elastase treatment in CARM1 deficient mouse lungs led to the accumulation of SP-C positive ATII cell. In our in vitro studies, we detected that the knockdown of CARM1 in the ATII-like cell line LA-4 led to decreased SIRT1 expression (0.034±0.003 vs. 0.022±0.001, p<0.05), but increased expression of p16 (0.27±0.013 vs. 0.31±0.010, p<0.5), p21 (0.81±0.088 vs. 1.28± 0.063, p<0.01) and induced a higher number of β-galactosidase-positive senescent cells (50.57%±7.36 vs. 2.21%±0.34, p<0.001), compared with scrambled siRNA. The senescence in CARM1 deficient cells was further augmented after CSE stimulation. Furthermore, we demonstrated that CARM1 deficiency impaired wound healing (32.18%±0.9512 vs. 8.769%±1.967 wound gap closure, p<0.001) of alveolar epithelial cells. The data confirmed that CARM1 reduction induced an accelerated senescence in LA-4 cells by attenuating the effect of SIRT1. Overall, both our in vivo and in vitro results revealed a novel function of CARM1 in regulating emphysema development and premature lung aging via alveolar senescence, as well as impaired regeneration, repair and differentiation of ATII cells.

Abstract

Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) zählt zu den häufigsten schweren Krankheiten weltweit und ist gekennzeichnet durch eine irreversible Abnahme der Lungenfunktion. Ein Hauptcharakteristikum von COPD ist das Emphysem, das sich stetig über einen langen Zeitraum fortschreitend entwickelt, und durch die Zerstörung alveolärer Strukturen, einhergehend mit vergrößerten Lufträumen und verringerter Alveolaroberfläche, gekennzeichnet ist. Ergebnisse aus Studien legen nahe, dass die Entwicklung des Emphysems durch die erhöhte Seneszenz von Zellen der Lunge beschleunigt wird, doch die genauen zugrundeliegenden Mechanismen sind noch nicht aufgeklärt. Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) spielen eine bedeutende Rolle bei zellulären Prozessen wie Regulation von Seneszenz, Zellproliferation, Differenzierung und Apoptose. Die Familie der PRMTs umfasst 11 Enzyme, die als Typ I, II, oder III klassifiziert werden, abhängig von ihrem Methylierungsmuster (asymmetrische Dimethylierung, symmetrische Dimethylierung oder Monomethylierung). Ein Mitglied der Familie ist PRMT4, ein Typ I Enzym, das auch unter dem Namen Coactivator-assoziierte Arginin-Methyltransferase 1 (CARM1) bekannt ist. Ursprünglich wurde CARM1 als Coactivator für Steroid-Hormon-Rezeptoren beschrieben. CARM1 methyliert Histon 3 und verschiedene weitere Nicht-Histon Proteine, die eine wichtige Rolle für die Transkriptionsregulation, das RNA-Splicing und den Stoffwechsel spielen. Darüberhinaus führt der komplette Verlust von CARM1 zu gestörter Differenzierung und Maturation von Typ II Alveolarepithelzellen (ATII). Weiterhin ist CARM1 von Bedeutung für die Regulation von zellulärer Seneszenz mittels CARM1-abhängiger Methylierung. Auf Grundlage dieser Arbeiten wurde die Hypothese aufgestellt, dass CARM1 die Entwicklung und das Voranschreiten des Emphysems reguliert. Um dies aufzuklären, wurde die Rolle von CARM1 am Verlust der Alveolen in einem Elastase-induzierten Emphysem-Mausmodell in vivo sowie in vitro mittels siRNA knockdown in ATII-ähnlichen LA4-Zellen untersucht. Die Entwicklung und das Voranschreiten des Emphysems wurden über einen Zeitraum von 161 Tagen beobachtet. Dabei zeigte sich eine progressive Abnahme verschiedener Lungenfunktionsparameter. Die mittlere Alveolarweite bestätigte die zeitabhängige Vergrößerung des Luftraumes und war direkt mit einer signifikanten Zunahme der dynamischen Lungencompliance korreliert. Außerdem wurde an späteren Zeitpunkten (Tag 56 und 161) eine entzündungsabhängige Progression des Emphysems beobachtet. Das Voranschreiten des Emphysems war mit einer zeitabhängigen Herunterregulierung von CARM1 insbesondere in Alveolarepithelzellen assoziiert. Die Gesamtaktivität von CARM1 war ebenso reduziert, erkennbar anhand von erhöhter CARM1-Phosphorylierung in der Lunge. Weiterhin zeigten mit Elastase behandelte CARM1 haploinsuffiziente Mäuse eine signifikant erhöhte Vergrößerung des Luftraumes (52.5±9.6 µm vs. 38.8±5.5 µm, p<0.01) sowie der Lungencompliance (2.8±0.32 µl/cmH20 vs. 2.4±0.4 µl/cmH20, p<0.04) verglichen mit Wildtyp-Kontrollmäusen. Das verringerte Level an CARM1 trug zur Seneszenz von Alveolarepithelzellen bei, bestätigt durch eine Reduktion des Anti-Seneszenz-Markers SIRT1 und durch die Induktion der Seneszenz-Marker p16 und β-Galactosidase in Alveolarepithelzellen. Des Weiteren wurde gezeigt, dass CARM1 Haploinsuffizienz die Transdifferenzierung von ATII zu ATI Zellen verhindert. Dabei führte die Elastase-Behandlung von CARM1-defizienten Mäusen zu einer Akkumulation von SP-C-positiven ATII-Zellen in der Lunge. Die in vitro Experimente haben gezeigt, dass der knockdown von CARM1 in ATII-ähnlichen LA4-Zellen zu einer verringerten SIRT1-Expression (0.034±0.003 vs. 0.022±0.001, p<0.05), und gleichzeitig zu einer erhöhten Expression von p16 (0.27±0.013 vs. 0.31±0.010, p<0.5), p21 (0.81±0.088 vs. 1.28± 0.063, p<0.01) führte. Weiterhin verursachte der CARM1 knockdown eine erhöhte Anzahl an β-Galactosidase-positiven seneszenten Zellen verglichen mit Kontroll-siRNA-behandelten Zellen (50.57%±7.36 vs. 2.21%±0.34, p<0.001). Die erhöhte Seneszenz in CARM1-defizienten Zellen wurde durch Stimulation mit Zigarettenrauchextrakt noch verstärkt. Weiterhin zeigte sich in den Alveolarepithelzellen eine verhinderte Wundheilung aufgrund CARM1-Defizienz (32.18%±0.9512 vs. 8.769%±1.967 Wundschließung, p<0.001). Diese Daten bestätigten, dass die Reduzierung von CARM1 eine beschleunigte Seneszenz in LA4-Zellen mittels Abschwächung von SIRT1-Effekten verursachte. Zusammenfassend zeigen die in vivo und vitro Ergebnisse eine neue Rolle von CARM1 bei der Regulierung der Emphysem-Entstehung und der vorzeitigen Lungenalterung, in erster Linie mittels Seneszenz von Alveolarepithelzellen, sowie beeinträchtigter Regenerierung, Reparatur und Differenzierung von ATII-Zellen.