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Fleck, Daniel (2015): Regulated intramembrane proteolysis of NRG1 type III dediates postnatal peripheral myelination. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Neuregulin-1 (NRG1) type III is a growth factor on the surface of neurons in the peripheral nervous system (PNS). It is required for initial myelination of nerves by Schwann cells after birth and for remyelination after injury. Neuregulin-1 type III is activated by cleavage (shedding) in its extracellular juxtamembrane region generating a membrane-bound N-terminal fragment (NTF) that contains a bioactive epidermal growth factor (EGF)-like domain. This domain signals to neighboring Schwann cells in a contact-dependent manner prompting the cells to initiate myelination. The β-site APP cleaving enzyme 1 (BACE1) was identified as the enzyme that cleaves NRG1 type III and promotes myelination. Consequently, loss of BACE1 cleavage results in dramatically reduced myelin sheaths around nerves in the PNS of BACE1 knockout mice. Besides its role in myelination, BACE1, better known as β-secretase, is also involved in the generation of the neurotoxic amyloid β-peptide (Aβ) which is the main component of amyloid plaques in the brain of patients suffering from Alzheimer’s disease (AD). The Aβ peptide is derived through sequential cleavage of the amyloid precursor protein APP, first by BACE1 in the extracellular domain and subsequently by the γ-secretase in the transmembrane domain (TMD). Inhibition of BACE1 and γ-secretase is therefore considered a promising therapeutic strategy for AD. However, this approach harbors the risk of mechanism-based side effects due to impaired processing of substrates beside APP such as NRG1 type III which is not only a substrate for BACE1 but like APP is also cleaved in its TMD by the γ-secretase. Adding another layer of complexity, ADAM10 and ADAM17, the so-called α-secretases of AD, also cleave NRG1 type III. In the first part of this study, the proteolytic processing of NRG1 type III in its ectodomain was investigated in detail. The precise juxtamembrane shedding sites of BACE1, ADAM10 and ADAM17 were determined by mass spectrometry and two novel cleavage sites of BACE1 and ADAM17 N-terminal of the EGF-like domain were discovered. Cleavage at these novel sites by ADAM17 and BACE1 results in the secretion of the EGF-like domain from NRG1 type III as α-sEGF and β-sEGF, respectively. Using novel monoclonal antibodies generated against the identified cleavage sites the processing of NRG1 type III could also be confirmed in primary neurons. The soluble EGF-like domains were found to be functionally active and induced signaling pathways required for myelination in cultured Schwann cells. Furthermore, β-sEGF rescued the myelination deficit in the PNS of a zebrafish model lacking BACE1, thereby demonstrating its activity in vivo. Using cell culture and the zebrafish model the effects of BACE1- and ADAM17-mediated shedding on the activity of the soluble EGF-like domains were carefully dissected. In contrast to published evidence, however, both the BACE1- as well as the ADAM17-shed sEGF were found to be equally active and to promote myelination in vivo. Together this suggests that NRG1 type III dependent myelination is not only controlled by membrane-retained NRG1 type III but also in a contact-independent manner via proteolytic liberation of the EGF-like domain. The second part of this study investigates the processing of the C-terminal fragment (CTF) which remains after shedding of NRG1 type III. Intramembranous cleavage of the CTF by the γ-secretase was previously shown to release the NRG1 intracellular domain, which acts as transcriptional regulator of proteins involved in neuronal maturation and brain plasticity. Interestingly, a mutation within the TMD of NRG1 type III is associated with an increased risk of schizophrenia linking γ-secretase processing of NRG1 type III to this neurological disorder. Using a novel antibody against the N-terminus of the NRG1 CTF it was possible to detect a NRG1 β-peptide that is secreted during γ-secretase cleavage and could potentially serve as marker for this processing. Moreover, by means of mass spectrometry, the precise cleavage sites within the TMD of NRG1 could be identified. Strikingly, the ɛ-like cleavage site was found to be located exactly at the position of the schizophrenia-associated mutation providing a possible mechanism for the reported interference of this mutation with γ-secretase cleavage. The evidence presented unambiguously establishes NRG1 type III as a γ-secretase substrate and provides a basis for further investigation of the mechanisms which link its processing to the development of schizophrenia. In summary and with regard to BACE1 and γ-secretase being prime targets for a potential AD therapy, the results of this work call for further careful investigation of the consequences of altered NRG1 type III signaling due to chronic treatment with inhibitors.

Abstract

Als Wachstumsfaktor auf der Oberfläche von Neuronen des peripheren Nervensystems (PNS) ist Neuregulin-1 (NRG1) Typ III nach der Geburt essentiell für die Ausbildung der die Nerven umgebenden Myelinscheiden durch Schwann-Zellen sowie zur Re-myelinisierung nach einer Verletzung. Hierfür wird NRG1 Typ III durch proteolytische Spaltung seiner extrazellulären Domäne (so genanntes Shedding) durch die Protease BACE1 (engl. β-site APP cleaving enzyme 1) aktiviert. Dabei entsteht ein membranständiges N-terminales Fragment (NTF), das in kontaktabhängiger Weise durch seine bioaktive, dem Epidermalen Wachstumsfaktor ähnliche (engl. epidermal growth factor, EGF) Domäne die Myelinisierung durch benachbarte Schwann-Zellen einleitet. Folglich führt der Verlust der BACE1-vermittelten Spaltung von NRG1 Type III in BACE1 Knockout-Mäusen zu stark reduzierten Myelinscheiden der peripheren Nerven. Neben seiner Rolle bei der Myelinisierung ist BACE1, besser bekannt als β-Sekretase, auch an der Bildung des neurotoxischen Amyloid β Peptides (Aβ), Haupt¬bestandteil der Amyloidplaques im Gehirn von Alzheimer-Patienten, beteiligt. Das Aβ Peptid entsteht durch die aufeinanderfolgende Spaltung des Amyloid-Vorläufer-Proteins APP (engl. amyloid precursor protein) erst durch BACE1 innerhalb der extra¬zellulären Domäne und anschließend durch die γ-Sekretase in der Transmembrandomäne (TMD). Die Hemmung von BACE1 und der γ-Sekretase gilt deshalb als vielversprechender Ansatz für die Therapie von Alzheimer. Allerdings könnte dies zu starken Nebenwirkungen führen, weil beispiels¬weise NRG1 Typ III wie APP auch von BACE1, der γ-Sekretase sowie von ADAM10 und ADAM17, den α-Sekretasen der Alzheimer Krankheit, prozessiert wird. Im ersten Teil dieser Studie wurde die proteolytische Prozessierung der Ektodomäne von NRG1 genauer untersucht. Mithilfe massenspektrometrischer Untersuchungen wurden die genauen Schnittstellen von BACE1, ADAM10 und ADAM17 in der extrazellulären membrannahen Region von NRG1 Typ III bestimmt und zusätzlich zwei neue Schnittstellen auf der N-terminalen Seite der EGF-ähnlichen Domäne identifiziert. Die proteolytische Spaltung von NRG1 Typ III durch ADAM17 und BACE1 an diesen zuvor unbekannten Stellen setzt die EGF-ähnliche Domäne von NRG1 Typ III als α-sEGF und β-sEGF frei. Mit neuen gegen die Schnittstellen gerichteter monoklonaler Antikörpern gelang es zudem, die Prozessierung von NRG1 Typ III auch in primären Nervenzellen nachzuweisen. Es wurde gezeigt, dass die löslichen EGF-ähnlichen Domänen funktional sind und die zur Ausbildung von Myelinscheiden notwendigen Signalkaskaden in Schwann-Zellen auslösen. Außerdem war β-sEGF in der Lage, den Myelinisierungsdefekt im PNS eines BACE1-defizienten Zebrafish-Modells zu beheben, was die Aktivität von β-sEGF in vivo bestätigt. Der Einfluss, den das Shedding durch BACE1 und ADAM17 auf die Aktivität der löslichen EGF-ähnlichen Domäne hat, wurde in Zellkultur und im Zebrafish-Modell ausführlich untersucht. Im Widerspruch zu bisher veröffentlichten Daten wurde festgestellt, dass sowohl das von BACE1 als auch das von ADAM17 geschnittene sEGF gleichermaßen aktiv ist und die Ausbildung von Myelinscheiden fördert. Zusammengenommen deutet dies darauf hin, dass die von NRG1 Typ III abhängige Myelinisierung nicht nur von membrangebundenem NRG1 Typ III gesteuert wird, sondern auch auf eine kontaktunabhängige Weise von der durch Proteolyse freigesetzten löslichen EGF-ähnlichen Domäne. Der zweite Teil dieser Studie befasst sich mit der Prozessierung des durch das Shedding von NRG1 Typ III entstandenen C-terminalen Fragments (CTF). Wie bereits früher gezeigt wurde, führt die Intramembranproteolyse des CTFs durch die γ-Sekretase zur Freisetzung der intrazellulären Domäne von NRG1, die an der Regulierung der neuronalen Reifung und der Plastizität des Gehirns beteiligt ist. Interessanterweise ist eine Mutation innerhalb der TMD von NRG1 Typ III mit einem erhöhten Risiko an Schizophrenie zu erkranken verbunden und stellt damit einen Zusammenhang zwischen der Prozessierung von NRG1 Typ III durch die γ-Sekretase und dieser neurologischen Erkrankung dar. Die Verwendung eines neuen Antikörpers gegen den N-Terminus des NRG1 CTFs ermöglichte es, ein NRG1 β Peptid zu detektieren, das während der Spaltung durch die γ-Sekretase freigesetzt wird und möglicherweise als Biomarker für diese Prozessierung dienen könnte. Des Weiteren konnten massen¬spektrometrisch die genauen Schnittstellen innerhalb der TMD von NRG1 identifiziert werden. Bemerkenswerterweise liegt die ɛ-ähnliche Schnittstelle genau an der Position der mit Schizophrenie assoziierten Mutation, was möglicherweise die von dieser Mutation ausgehende Beeinträchtigung der γ-Sekretase-bedingten Spaltung, über die früher schon berichtet wurde, erklären könnte. Die hier vorgelegten Daten zeigen eindeutig, dass NRG1 Typ III ein Substrat der γ-Sekretase ist und bereiten die Grundlage für weiterführende Untersuchungen des Zusammenhangs zwischen der Prozessierung von NRG1 Typ III und der Entwicklung von Schizophrenie. Vor dem Hintergrund, dass die Hemmung bzw. Modulation von BACE1 und der γ-Sekretase als vielversprechende Strategie zur Behandlung der Alzheimer Krankheit gilt, machen die Ergebnisse dieser Arbeit deutlich, dass es weiterer Untersuchungen der Auswirkungen bedarf, die eine veränderte Signalübertragung von NRG1 Typ III aufgrund der Hemmung dieser beiden Enzyme zur Folge hätte.