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Dolinsky, Stephanie (2014): The Legionella longbeachae Icm/Dot substrate SidC binds to the LCV through PtdIns(4)P and facilitates the interaction with the ER. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

The genus Legionella consists of environmental bacteria which are the causative agents of the severe pneumonia Legionnaires’ disease. L. longbeachae and L. pneumophila are able to replicate intracellularly in human alveolar macrophages and aquatic or soil amoebae. In order to replicate within host cells the bacteria establish a compartment derived from the endoplasmatic reticulum (ER) which is called “Legionella-containing vacuole” (LCV). A bacterial intracellular multiplication/defective in organelle transport (Icm/Dot) type IV secretion system (T4SS) is essential for the formation of this LCV. The Icm/Dot T4SS enables translocation of effector proteins into the host cell. More than 100 effector proteins are presumably translocated during an L. longbeachae infection whereas around 300 translocated effector proteins are known for L. pneumophila. During maturation the LCV communicates with vesicles from the endocytic vesicle trafficking pathway, avoids fusion with lysosomes and instead fuses with the ER. Phosphoinositides (PI) such as phosphatitdylinositol-4-phosphate (PtdIns(4)P) are enriched on the LCV which mediate the binding of Icm/Dot translocated effector proteins like SidCLpn (substrate of Icm/Dot transporter) as well as its paralogous protein SdcALpn. The 73 kDa effector SidM but not the 106 kDa SidCLpn was found in a previous phosphoinositide pulldown assay with L. pneumophila lysate to be the major PtdIns(4)P binding protein. Using L. longbeachae lysate we showed binding of the 111 kDa SidCLlo to PtdIns(4)P in a phosphoinositide pulldown. This result was confirmed by protein-lipid overlay assays using “PIP-strips”. In further analysis the P4C (PtdIns(4)P-binding of SidC) domain was identified as a 19 kDa domain of SidCLlo located in the amino acid region 609 to 782. This P4C domain was located in the same region as the 20 kDa SidCLpn_P4C domain of L. pneumophila. Both P4C domains can be used as LCV markers. This was shown with GST-tagged proteins binding to LCVs in a cell homogenate. The two P4C domains show a sequence identity of only 45% and the full-length protein of 40%. Circular dichroism measurements revealed that the secondary structure of the two proteins is similar. Moreover, isothermal titration calorimetric measurements indicated a 3.4 higher affinity of SidCLlo towards PtdIns(4)P compared with SidCLpn. In RAW 264.7 macrophages infected with L. longbeachae we showed that endogenous SidCLlo as well as heterologously produced SidCLpn is translocated to the LCV in an Icm/Dot-dependent manner. The deletion of the sidCLlo gene led to a reduced recruitment of calnexin to the LCV in infected Dictyostelium discoideum. This effect was complemented by adding plasmid-encoded SidCLlo, SidCLpn or SdcALpn. The same recruitment defect for a L. pneumophila strain lacking the sidCLpn and sdcALpn genes was complemented by the production of SidCLlo and SidCLpn as published before. Therefore, these effectors play a role for pathogen-host interactions by promoting the recruitment of ER to the LCV. L. longbeachae or L. pneumophila wild-type strains outcompeted their sidC deletion mutant in a competition assay in Acanthamoeba castellanii. However neither of the deletion mutants were impaired in their growth in single strain replication experiments. In summary despite of the small sequence identity and the higher binding affinity to PtdIns(4)P of SidCLlo compared to SidCLpn both effector proteins seem to have similar functions during an infection of Legionella. For the characterization of L. longbeachae-containing vacuoles through proteomic analysis, LCVs had to be isolated from infected D. discoideum or RAW 264.7 macrophages. Endogenous SidCLlo or heterologously produced SidCLpn were used as LCV markers for the isolation. Pathogen vacuoles harbouring L. longbeachae were isolated by immuno-affinity purification using antibodies specifically recognizing SidCLlo or SidCLpn. Future investigations aim at optimizing the LCV purification protocol for L. longbeachae to determine the proteome composition of the L. longbeachae-containing vacuole.

Abstract

Die Gattung Legionella besteht aus opportunistischen Pathogenen, die Auslöser für die schwere Lungenentzündung Legionärskrankheit sind. Die Legionella-Spezies L. longbeachae sowie L. pneumophila vermehren sich intrazellulär in humanen alveolaren Makrophagen sowie in aquatischen oder im Boden lebenden Amöben. Ein vom endoplasmatischen Retikulum (ER) abstammendes Kompartiment ist notwendig für die intrazelluläre Replikation. Diese Nische wird als „Legionella-containing vacuole“ (LCV) bezeichnet. Die Bildung der LCV benötigt ein „intracellular multiplication/defective in organelle transport“ (Icm/Dot) Typ IV Sekretionssystem (T4SS), das Effektorproteine in die Wirtszelle transportiert. Zurzeit sind über 100 vermutete Effektorproteine für L. longbeachae und etwa 300 Effektorproteine für L. pneumophila beschrieben. Im Verlauf eines Reifungsprozesses kommuniziert die LCV mit endosomalen Vesikeln, verhindert eine Fusion mit den Lysosomen und fusioniert mit dem ER. Phosphoinositide wie das PtdIns(4)P wurden auf der LCV gefunden. Diese dienen als Bindestellen für die durch das Icm/Dot translozierten Effektorproteine wie das SidCLpn und sein paraloges Protein SdcALpn. In einer früheren Studie wurde in einem Phosphoinositid-Pulldown Experiment das 73 kDa Effektorprotein SidM aber nicht das 106 kDa Protein SidCLpn als Bindepartner von PtdIns(4)P nachgewiesen. Wir konnten in einem Phosphoinositid-Pulldown Experiment mit L. longbeachae Lysat zeigen, dass das 111 kDa homologe Protein von SidCLpn SidCLlo der Bindepartner von L. longbeachae für PtdIns(4)P ist. Ein 19 kDa großes SidCLlo- Fragment im Bereich der Aminosäuren 609 bis 782 konnte identifiziert werden, das für die Bindung von SidCLlo an PtdIns(4)P notwendig ist. Interessanterweise liegt die früher beschriebene 20 kDa große P4C Domäne von SidCLpn in der gleichen Region. Durch Inkubation von GST-gekoppelten SidCLlo_P4C-Proteinen mit L. pneumophila Zellhomogenat konnten wir zeigen, dass SidCLlo_P4C die Vakuole von L. pneumophila homogen dekoriert. Daher kann SidCLlo_P4C genauso wie das SidCLpn_P4C als LCV Marker benutzt werden. Die P4C Domänen besitzen eine Sequenzhomologie von 45% und SidCLlo und SidCLpn zeigen eine Sequenzhomologie von 40%. Mittels zirkularer Dichroismus Messung konnte gezeigt werden, dass die beiden Proteine ähnliche Sekundärstrukturen besitzen. Mittels isothermer Titrationskalorimetrie konnten wir zeigen, dass SidCLlo eine 3.4-fach höhere Bindeaffinität zu PtdIns(4)P besitzt als SidCLpn. In infizierten RAW 264.7 Makrophagen konnte wir zeigen, dass L. longbeachae nicht nur sein eigenes endogen produzierten SidCLlo sondern auch ein heterolog exprimiertes SidCLpn in einer Icm/Dot abhängigen Art und Weise auf die LCV transloziert. Frühere Studien zeigten, dass in einer sidC-sdcALpn Deletionsmutante die ER Rekrutierung zu der LCV in infizierten D. discoideum Zellen beeinträchtigt ist. Wir konnten zeigen, dass die heterologe Produktion von SidCLlo diesen Rekrutierungsfehler komplementieren kann, ebenso wie Plasmid-kodiertes SidCLpn oder SdcALpn. Die Deletion vom Gen sidCLlo in L. longbeachae führt ebenfalls zu einer verminderten Rekrutierung von ER-Markern zur LCV in infizierten D. discoideum. Dieser Effekt konnte durch eine Produktion von SidCLlo, SidCLpn und SdcALpn komplementiert werden. Die SidC Deletionsstämme von L. longbeachae oder L. pneumophila replizierten in Acanthamoeba castellanii wie die entsprechenden Wildtyp-Stämme, aber in direkter Konkurrenz wurden die Deletionsmutanten von den Wildtyp-Stämmen verdrängt. Insgesamt scheinen trotz der geringen Sequenzidentität und der höheren Bindeaffinität von SidCLlo im Vergleich zu SidCLpn zu PtdIns(4)P beide Effektorproteine ähnliche Funktionen im Infektionsweg von Legionella wahr zu nehmen. Für die Charakterisierung von L. longbeachae-enthaltenden Vakuolen in einer Proteomanalyse müssen LCVs aus D. discoideum oder RAW 264.7 Makrophagen isoliert werden. Endogenes SidCLlo oder heterolog produziertes SidCLpn wurden als Vakuolen- Marker für die Isolation von L. longbeachae-enthaltenen Vakuolen verwendet. L. longbeachae-enthaltene Vakuolen wurden in einer Immunaffinitätsaufreinigung mit Hilfe spezifischer Antikörper gegen SidCLlo oder SidCLpn isoliert. Weitere Studien zielen auf die Verbesserung der Vakuolen-Isolation von L. longbeachae, um das Proteom dieser LCV zu charakterisieren.