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Bentmann, Eva (2014): Stress granule recruitment and deposition of proteins of the FET family and TDP-43 in ALS and FTD. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Neurodegenerative diseases such as Alzheimer´s disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD) are defined by progressive and selective loss of neurons. With increasing age the risk of developing a neurodegenerative disease exponentially rises. To date these diseases are untreatable, imposing a significant medical, social and financial burden onto our ageing society. Typical features of neurodegenerative diseases are abnormal aggregation of a disease characterizing protein and its deposition in pathological inclusions. A unifying feature in the majority of ALS cases and several subtypes of FTD is the pathological deposition of the TAR DNA-binding protein of 43kDa (TDP-43) or the Fused in Sarcoma (FUS) protein. Furthermore, stress granule (SG) marker proteins are consistently detected in FUS inclusions, suggesting that SGs might be involved in the formation of FUS inclusions. However, whether pathologic TDP-43 inclusions contain SG marker proteins is still controversially discussed. In this thesis I demonstrate that cytosolically mislocalized full-length TDP-43 is recruited into SGs, whereas C-terminal fragments of TDP-43 (TDP-CTFs) fail to localize to SGs. In accordance with these cell culture data, spinal cord inclusions in ALS and FTD patients contain full-length TDP-43 and SG marker proteins. In contrast, hippocampal inclusions are enriched for TDP-CTFs but are SG marker-negative. Thus, the protein composition of TDP-43 inclusions determines whether SG marker proteins are co-deposited in TDP-43 inclusions or not. By analyzing the prerequisites for SG recruitment of TDP-43 and FUS, I demonstrate that cytosolic mislocalization of TDP-43 and FUS is required for their localization in SGs. Additionally, I found that both proteins have the same requirements for SG recruitment, as their main RNA-binding domain and a glycine-rich domain are essential for SG localization. A detailed analysis of the protein composition of FUS inclusions in ALS and FTD cases unveiled that FUS inclusions in FTD cases contain not only FUS, but all FET (FUS, Ewing sarcoma protein (EWS), TATA binding protein-associated factor 15 (TAF15)) family proteins. Here, I provide evidence that this cytosolic deposition of FET proteins can be mimicked in cultured cells by inhibition of Transportin-mediated nuclear import, which causes cytosolic mislocalization of all FET proteins and recruitment of these proteins in SGs. In contrast to FTD cases, FUS inclusions in ALS cases contain only FUS, but not EWS and TAF15. In line with that, I show that ALS-associated FUS mutations result in cytosolic mislocalization of FUS that is upon subsequent cellular stress sequestered into SGs. These SGs then contain only FUS but not EWS or TAF15, demonstrating that mutant FUS is unable to co-sequester EWS or TAF15. In addition, I contributed to two studies that revealed that nuclear import defects are involved in the pathogenesis of ALS and FTD. ALS associated FUS mutations are frequently located within the proline-tyrosine nuclear localization signal (PY-NLS) of FUS and thus disrupt Transportin-mediated nuclear import and cause cytosolic mislocalization of FUS. EWS and TAF15 also contain a PY-NLS and thus are imported into the nucleus via Transportin. This interaction between Transportin and FET proteins can be modulated by arginine methylation that reduces Transportin binding. In FTD patients with FUS inclusions, this post-translational modification seems to be defective, as FUS inclusions in these cases contain hypomethylated FUS. Taken together, these data provide evidence that nuclear import defects and sequestration of FUS and TDP-43 in SGs are consecutive steps in the pathogenesis of ALS and several subtypes of FTD.

Abstract

Neurodegenerative Erkrankungen wie die Alzheimer-Erkrankung, die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) und die Frontotemporale Demenz (FTD) sind durch den progressiven und selektiven Verlust von Neuronen gekennzeichnet. Mit steigendem Alter nimmt das Risiko eine neurodegenerative Erkrankung zu entwickeln exponentiell zu. Bislang gelten diese Krankheiten als nicht behandelbar, was eine signifikante medizinische, soziale und finanzielle Belastung für unsere alternde Gesellschaft darstellt. Typische Charakteristika neurodegenerativer Erkrankungen sind die abnormale Aggregation eines Krankheits-assoziierten Proteins, sowie dessen Anhäufung in pathologischen Ablagerungen. Gemeinsames Merkmal der meisten ALS Fälle und bestimmter Untergruppen von FTD sind pathologische Ablagerungen, die hauptsächlich das TAR DNA-binding protein of 43kDa (TDP-43) oder das Fused in Sarcoma (FUS) Protein enthalten. In FUS Ablagerungen werden stets auch Markerproteine für Stress-Körnchen (engl. stress granules, SG) detektiert, was darauf schließen lässt, dass SGs an der Bildung von FUS Ablagerungen beteiligt sein könnten. Bei pathologischen TDP-43 Ablagerungen ist hingegen immer noch umstritten ob diese SG Markerproteine enthalten. In der vorliegenden Arbeit konnte ich zeigen, dass zytosolisch mislokalisiertes, unfragmentiertes TDP-43 in SGs rekrutiert wird, wohingegen C-terminale Fragmente von TDP-43 (TDP-CTFs) nicht in SGs lokalisieren. Diese Ergebnisse stimmen mit den Beobachtungen in ALS und FTD Patienten überein, wo TDP-43 Ablagerungen im Rückenmark unfragmentiertes TDP-43 und SG Markerproteine enthalten. Im Gegensatz dazu sind hippocampale Ablagerungen mit TDP-CTFs angereichert, enthalten jedoch keine SG Marker. Die Proteinzusammensetzung der TDP-43 Ablagerungen bestimmt also, ob SG Markerproteine darin abgelagert werden oder nicht. Bei der Bestimmung von Voraussetzungen für die Rekrutierung von TDP-43 und FUS in SGs konnte ich feststellen, dass eine zytosolische Umverteilung notwendig ist, damit TDP-43 und FUS in SGs sequestriert werden können. Des Weiteren konnte ich zeigen, dass beide Proteine ihre Haupt-RNA-bindende Domäne, sowie die Glycin-reiche Domäne für die Lokalisierung in SGs benötigen. Eine detaillierte Analyse der Proteinzusammensetzung von FUS Ablagerungen in ALS und FTD hat aufgedeckt, dass FUS Ablagerungen in FTD-Patienten nicht nur FUS, sondern alle FET (FUS, Ewing sarcoma protein (EWS), TATA binding protein-associated factor 15 (TAF15)) Familienproteine beinhalten. Ich konnte zeigen, dass diese cytosolische Ablagerung von FET Proteinen in Zellkultur durch eine Hemmung des Transportin-vermittelten Kerntransports nachgestellt werden kann, da dies zur zytosolischen Anhäufung aller FET Proteine und deren Rekrutierung in SGs führt. Im Gegensatz zu FTD Fällen enthalten FUS Ablagerungen in ALS nur FUS, nicht aber EWS und TAF15. In Zellkultur-Experimenten konnte ich zeigen, dass ALS-assoziierte FUS Mutationen zur zytosolischen Umverteilung von FUS führen, welches dann durch nachfolgenden zellulären Stress in SGs rekrutiert wird. Diese SGs enthalten FUS, jedoch nicht EWS oder TAF15, was beweist, dass mutiertes FUS nicht wildtypisches EWS oder TAF15 sequestrieren kann. Darüber hinaus habe ich an zwei Publikationen mitgearbeitet, in denen gezeigt wurde, dass Defekte im Kernimport an der Pathogenese von ALS und FTD beteiligt sind. ALS-assoziierte FUS Mutationen sind häufig im Prolin-Tyrosin Kernlokalisierungs-Signal (PY-NLS) lokalisiert und zerstören so den Transportin-vermittelten Kernimport und führen zur zytosolischen Misslokalisierung von FUS. EWS und TAF15 enthalten ebenfalls ein PY-NLS und werden daher über Transportin in den Kern importiert. Die Interaktion zwischen Transportin und den FET Proteinen kann durch Arginin-Methylierung moduliert werden, welche die Transportin-Bindung reduziert. In FTD Patienten mit FUS Ablagerungen scheint diese post-translationale Modifikation gestört zu sein, da FUS Ablagerungen in diesen Fällen hypomethyliertes FUS enthalten. Diese Daten liefern Beweise dafür, dass Defekte im Kernimport und die Sequestrierung von FUS und TDP-43 in SGs aufeinanderfolgende Schritte in der Pathogenese von ALS und verschiedenen Varianten von FTD sind.