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Sen, Dity (2013): Characterization of the putative CALM/AF10 collaborator Meis1 in leukemia development, Charakterisierung der möglichen Kollaboration von Meis1 mit CALM/AF10 im Krankheitsverlauf der Leukämie. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Chromosomal translocations are common in human leukemias. Detailed studies of chromosomal translocation have been useful in understanding the pathogenesis and identifying therapeutic targets in hematologic malignancies. Some translocations result in the formation of fusion genes. These fusion proteins play an important role in leukemogenesis. The t(10;11)(p12;q14) translocation is rare but recurring and results in the formation of the CALM/AF10 fusion protein. Patients with this translocation have a bad prognosis. To understand how CALM/AF10 leads to leukemia, various mouse models have been established. In a murine bone marrow retroviral transduction and transplantation model Deshpande et al. (2006) showed that mice expressing CALM/AF10 in their bone marrow cells developed an acute myeloid leukemia with a penetrance of 100% and a short latency period of 110 days. Using a transgenic mouse model, in which CALM/AF10 was under the control of Vav promoter, Peter Aplan and colleagues demonstrated that only 40% to 50% of mice developed leukemia after a long latency of 10 to 12 months. Two classical transgenic CALM/AF10 models were established in our group using the immunoglobulin heavy chain enhancer/promoter (IgH-CALM/AF10) and proximal murine LcK promoter (pLck-CALM/AF10) to drive CALM/AF10 expression. These transgenic mice did not show any leukemic phenotype even after an observation period of 15 months. Taken together these studies strongly suggest that additional collaborating factors are required for the CALM/AF10 fusion gene to induce leukemia. Meis1, a Hox cofactor, is known to collaborate with several Hox genes and Hox fusion genes such as HOXA9 and NUP98-HOXD13. In these studies, Meis1 played a critical role in accelerating the development of leukemia. It could also be shown that MEIS1 is highly expressed in CALM/AF10 positive human leukemia cells. Therefore, I sought to determine whether the homeobox gene Meis1 collaborates with CALM/AF10 in inducing leukemia. In order to achieve this goal, lethally irradiated non-transgenic mice were transplanted with IgH-CALM/AF10 transgenic bone marrow cells transduced with a Meis1 expressing retrovirus. The transplanted mice developed an acute leukemia with a penetrance of 100% and a median latency period of 187 days. The leukemia showed predominantly myeloid features such as the presence of myeloid marker positive cells. The myeloid blast cells infiltrated in multiple hematopoietic as well as non-hematopoietic organs. The leukemic cells were also positive for the B-cell marker B220. Cells that were positive for both lymphoid and myeloid markers, a characteristic feature of CALM/AF10-induced leukemia, were also detected in all the mice. The leukemic cells had clonal DJH rearrangements. Overall, these data suggest that the transformed cell might be an early progenitor cell capable of lymphoid as well as myeloid differentiation or that the leukemia was initiated by a B220+ IgH DJ rearranged cell with blocked lymphoid differentiation, which started a default myeloid differentiation program. By performing serial secondary and tertiary transplantations the leukemic nature of the disease could be confirmed. Colony forming cell assays showed that CALM/AF10 in collaboration with Meis1 failed to induce the transformation of hematopoietic progenitors in vitro. This could either be due to the lack of required growth factors and conditions necessary for the proliferation of the transformable cell or lack of additional events essential for progression towards leukemia development. In conclusion, I have demonstrated that Meis1 collaborates with CALM/AF10 in inducing acute myeloid leukemia. Additional, detailed analyses of the leukemia initiating cell in these models would help to better understand the pathogenesis of CALM/AF10-induced leukemia.

Abstract

Translokationen treten bei humanen Leukämien sehr häufig auf. Die Analyse von Chromosomentranslokationen hat sowohl zum Verständnis der Pathogenese von Leukämien als auch zur Identifizierung von therapeutischen Zielen geführt. Manche Translokationen führen zur Bildung von Fusionsgenen. Diese Fusionsproteine spielen in der Leukämogenese eine wichtige Rolle. Das Fusionsprotein CALM/AF10 entsteht durch die seltene, aber wiederholt auftretende Translokation t(10;11)(p12;q14). Patienten mit dieser Translokation haben eine schlechte Prognose. Um zu verstehen, wie es von der Expression des Proteins CALM/AF10 zum Ausbruch der Leukämie kommt, wurden verschiedene Mausmodelle etabliert. Deshpande et al. (2006) konnten in einem Mausknochenmarktransplantationsmodell nach retroviraler Transduktion zeigen, dass die Expression von CALM/AF10 zu einer akuten myeloischen Leukämie mit einer Penetranz von 100% und einer kurzen Latenzzeit von 110 Tagen führt. In einem transgenen Mausmodell, bei dem CALM/aF10 unter der Kontrolle des Vav-Promotors exprimiert wurde, wurden von Peter Aplan und Kollegen in lediglich 40 - 50% der Mäuse nach einer langen Latenzzeit von 10 bis 12 Monaten Leukämien beobachten. In unserer Gruppe wurden zwei klassische transgene CALM/AF10-Mausmodelle entwickelt, bei denen CALM/AF10 vom Immunglobulin Heavy-Chain Enhancer Promotor (IgH-CALM/AF10) bzw. vom proximalen murinen Lck-Promoter (pLck-CALM/AF10) gesteuert wurde. Diese transgenen Mäuse zeigten auch nach 15 monatiger Beobachtungszeit noch immer keinen leukämischen Phänotyp. Zusammenfassend zeigen diese Studien, daß neben dem Fusionsgene CALM/AF10 weitere Faktoren zur Induktion von Leukämie notwendig sind. Von Meis1, einem Hox–Kofaktor, ist bekannt, dass es mit mit einigen Hox Genen und auch Hox Fusionsgenen, wie HOXA9 und NUP-HOXD13, kollaboriert. In diesen Studien spielte Meis1 eine wichtige Rolle in der Beschleunigtung der Leukämieentwicklung. Ebenfalls konnte gezeigt werden, daß MEIS1 in CALM/AF10 positiven humanen Leukämiezellen sehr hoch exprimiert wird. Aufgrund dieser Beobachtungen beschloss ich nachzuweisen, ob das Homeoboxgen Meis1 mit CALM/AF10 bei der Leukämieentwicklung kollaboriert. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden letal bestrahlte, nicht transgene Mäuse mit IgH-CALM/AF10 transgenen Knochenmarkszellen transplantiert, die mit Meis1 exprimierendem Retrovirus transduziert wurden. Die transplantierten Mäuse entwickelten eine akute Leukämie mit einer Penetranz von 100% und einer mittleren Latenzzeit von 187 Tagen. Die Leukämie zeigte vorwiegend myeloische Eigenschaften mit myeloischen Oberflächenmarkern. Die Blasten infiltrierten sowohl hämatopoetische als auch in nicht hämatopoetische Organe. Die Leukämiezellen waren ebenfalls positiv für den B-Zellmarker B220. Auch Zellen, die sowohl für lymphoide als auch myeloische Marker positiv waren – dies ist ein charakteristisches Zeichen für CALM/AF10 induzierte Leukämie – wurden in allen Mäusen gefunden. Die Leukämiezellen hatten klonale DJH Umlagerungen. Insgesamt lassen diese Daten den Schluss zu, dass die transformierte Zelle eine frühe Vorläuferzelle sein könnte, die sowohl zur lymphatischen als auch zur myeloischen Differenzierung fähig ist oder daß die Leukämie in einer B220+ IgH DJ rearrangierten Zelle mit blockierter lymphatischer Differenzierung entstanden ist, bei der das Standardprogramm der myeloischen Differenzierung abgerufen wurde. Durch Transplantation in sekundäre und tertiäre Rezipientenmäuse konnte bestätigt werden, dass es sich in der Tat um eine Leukämie handelte. Im Colony Forming Cell-Assay hingegen führte die Kollaboration von CALM/AF10 mit Meis1 nicht zur Transformation von hämatopoetischen Vorläuferzellen. Dies könnte zum einen daran liegen, dass notwendige Wachstumsfaktoren und Wachstumsbedingungen für die Proliferation der transformierbaren Zellen fehlten, oder, dass zusätzlichen genetische Ereignissen, die für die Leukämieentstehung essentiell sind, nicht vorhanden waren. Zusammenfassend konnte ich zeigen, daß Meis1 mit CALM/AF10 bei der Induktion der akuten myeloischen Leukämie kollaboriert. Zusätzliche, detailliert Analysen der Leukämie induzierenden Zellen in diesem Modell würden helfen, die Pathogenese der CALM/AF10 induzierten Leukämie besser zu verstehen.