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Meyer, Dorke (2013): Identifizierung und funktionelle Charakterisierung von Geschmacksrezeptoren in Spermien. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Ein bislang nur wenig verstandenes chemo¬sensorisches Zellsystem stellen Spermien dar, die im weib¬lichen Genital¬trakt komplexe Gemische ganz verschiedener Liganden wahr-nehmen müssen, um ihre für eine erfolgreiche Befruchtung essentiellen Aufgaben erfüllen zu können. Dazu gehören u. a. ein sekundärer Reifungsprozess (Kapazitierung), die Weg¬findung zur Eizelle im Eileiter und die Akrosom¬reaktion zur enzymatischen Auflösung der Glyko¬protein¬matrix (Zona pellucida) der Oocyte. Die Sensor¬moleküle auf der Oberfläche des Spermiums, die eine Erkennung bestehender Konzentrations-gradienten von Amino¬säuren, Kohlen¬hydraten, Hormonen, von verschiedensten Ionen und Protonen im luminalen Milieu des weiblichen Genital¬trakts sowie der Kohlenhydrat-reichen Zona pellucida ermöglichen, sind jedoch trotz ihrer Bedeutung für eine erfolgreiche Fertilisation weitgehend unbekannt. Geschmacks¬rezeptoren repräsentieren spezialisierte Erkennungs¬moleküle, die in Sinnes-zellen der Zunge die präzise Detektion eines breiten Spektrums chemisch sehr diverser Geschmacks¬stoffe ermöglichen, welche auffällige Ähnlichkeiten mit den potentiellen Liganden in der wässrigen Umgebung von Spermien im weiblichen Genital¬trakt aufweisen. Interessanterweise werden diese Rezeptorproteine aber nicht nur in Geschmacks¬sinneszellen, sondern auch in chemosensorischen Zellen einer Vielzahl extra-oraler Gewebe exprimiert. In der vorliegenden Arbeit wurde deshalb mit Hilfe biochemischer, molekular- und zell-biologischer Techniken sowie mit reproduktions¬biologischen Methoden und unter Verwendung Geschmacks¬rezeptor-defizienter Mäuse der Frage nachgegangen, ob Rezeptor¬moleküle des Geschmacks¬systems als Kandidaten für chemische Sensor-moleküle von Spermien in Betracht kommen. Dabei wurde ein Detektions¬molekül für saure Geschmacksstoffe, der PKD2L1, immun-cyto¬chemisch im Hoden der Maus und in reifen murinen Spermien nach¬gewiesen. Funktionell könnte dieser im Flagellum von Spermien exprimierte Ionenkanal an der Registrierung der verschiedenen Protonen¬konzentrationen im Milieu des weib¬lichen Genital¬trakts beteiligt sein. Weiterhin konnte eine Expression von gustatorischen GPCRs der Tas1r-Familie (süß/umami) und Tas2r-Familie (bitter), in männ¬lichen Reproduktions¬organen und in reifen Spermien gezeigt werden. Zudem wurden Hinweise auf die Expression der gustatorischen G Protein α Untereinheit Gustducin, die in Geschmacks¬sinnes¬zellen an der Signal¬transduktion dieser beiden Rezeptor¬familien beteiligt ist, im männlichen Reproduktions¬system erbracht. Im Einzelnen konnten mit der RT-PCR-Technik Transkripte von 28 der insgesamt 35 Mitglieder der großen Familie der murinen Bitter¬rezeptoren (Tas2rs) aus Hoden-gewebe amplifiziert werden. Die Bedeutung der Expression von Bitter¬rezeptoren für die Reproduktion wurde exemplarisch anhand einer Gen-defizienten Maus für den Tas2r131 unter¬sucht. Bei dieser Knockin-Maus¬linie war die kodierende Rezeptor¬sequenz durch eine GFP-Expressions¬kassette ersetzt worden, so dass das Maus¬modell gleich-zeitig auch eine Bestätigung der Expression des Tas2r131 in späten Keim¬zell¬stadien der Spermato¬genese ermöglichte. Bei der Fertilitätsanalyse Tas2r131-defizienter Tiere waren unter Labor-Zucht¬bedingungen keine Veränderungen in der Anzahl der Nach¬kommen pro Wurf oder der Zeitspanne zwischen den Würfen feststellbar. Allerdings wiesen Tas2r131-defiziente Männ¬chen signifikant mehr epididymale Spermien auf als Wildtyp-Tiere. Darüber hinaus war bei Verpaarungs¬studien mit hetero¬zygoten Männchen eine Genotyp-Verschiebung zugunsten des Tas2r131 [-] Allels zu registrieren. Dieser Phänotyp könnte darauf hindeuten, dass der Tas2r131 eine funktionelle Rolle bei Tas2r-abhängigen Auswahlprozessen verschiedener Spermien¬populationen spielt, bei denen sich z. B. durch eine Regulation der Apoptose im Verlauf der Keimzell¬bildung (Spermatogenese) oder auch durch eine Beeinflussung z. B. der Weg¬findung im weiblichen Genitaltrakt ein Selektions¬vorteil für Tas2r131-defiziente Spermien ergeben könnte. Aus der Familie der Tas1-Rezeptoren, deren drei Mitglieder als Heterodimere für die Erkennung von süßen Stimuli und dem Geschmack von Mononatrium¬glutamat („umami“) verant¬wort¬lich sind, konnten in RT-PCR-Experimenten die beiden Unter-einheiten des Umami-Rezeptors, der Tas1r1 und Tas1r3, aus Hodengewebe der Maus amplifiziert werden. Mit Hilfe Subtyp- und Spezies-spezifischer Antikörper konnte gezeigt werden, dass beide Rezeptor¬proteine im Akrosom und in distinkten Abschnitten des Flagellums von murinen und humanen Spermien exprimiert werden. Die funktionelle Rolle des Umami-Rezeptors wurde mit Hilfe einer Tas1r1-defizienten mCherry Reportermauslinie unter¬sucht, die unter optimalen Zuchtbedingungen ebenfalls keine Fertilitäts¬einschränkungen erkennen ließ. Im Hoden dieser Tas1r1-defizienten Tiere waren jedoch morpho¬logische Veränderungen des Keim¬epithels und eine signifikant erhöhte Apoptose¬rate zu registrieren, die allerdings keine verminderte Anzahl reifer Spermien oder Störungen der Morphologie oder Motilität dieser Zellen zur Folge hatte. Stimulierungsexperimente mit isolierter Zona pellucida, dem physiologischen Auslöser der Akrosomreaktion, haben zudem gezeigt, dass keine Ein¬schränkungen bei Spermien Tas1r1-defizienter Tiere fest¬zustellen waren. Allerdings wiesen Tas1r1-defiziente Spermien eine signifikant höhere Rate an spontaner Akrosom¬reaktion auf, die in unkapazitierten Zellen mit signifikant erhöhten basalen Konzentrationen der second messenger cAMP und Ca2+ einherging. Durch eine Reduzierung der intra¬zellulären Konzentrationen dieser Botenstoffe, die elementare Aufgaben des Spermiums im Verlauf des sequentiellen Prozesses der Fertilisation regulieren, könnten Tas1-Rezeptoren somit durch eine basale Rezeptor-aktivität oder durch eine Liganden-induzierte Rezeptor¬stimulation sicherstellen, dass Spermien im weiblichen Genitaltrakt in einem Ruhezustand erhalten werden, bevor sie in Kontakt mit der Eizelle kommen können. Insgesamt kann dieser Nachweis einer funktionellen Expression von Geschmacks-rezeptoren in Spermien zu einem besseren Verständnis der Regulations¬mechanismen zentraler Spermien¬funktionen beitragen und langfristig möglicherweise auch repro-duktions¬medizinische Perspektiven zur gezielten positiven bzw. negativen Manipulation von Spermien und damit zur Behandlung männlicher Infertilität bzw. zur Entwicklung nicht-hormoneller Verhütungsmittel für den Mann eröffnen.