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Charakterisierung des Quorum Sensings in Yersinia enterocolitica unter Kultur- und Infektionsbedingungen
Charakterisierung des Quorum Sensings in Yersinia enterocolitica unter Kultur- und Infektionsbedingungen
In dieser Arbeit wurde Quorum Sensing (QS) in dem mauspathogenen Bakterium Yersinia enterocolitica WA-P Serogruppe 08 in vitro und im Mausinfektionsmodell untersucht. QS beschreibt das Phänomen, welches Einzelbakterien erlaubt, die Anzahl der Bakterien innerhalb einer Population über die Konzentration von Signalmolekülen zu messen. Der untersuchte Stamm synthetisiert lediglich das N-(3-Oxohexanoyl)-Homoserinlakton (OHHL) als Signalmolekül, während Yersinien anderer Serogruppen über ein weiteres Homoserinlakton (HHL) verfügen. Es wurde gezeigt, dass die OHHL-Produktion von den Wachstumsbedingungen abhängt aber auch stammspezifisch sein kann. So synthetisierte der Stamm 8081 der gleichen Serogruppe 08 unter vergleichbaren Wachstumsbedingungen nur 1/10 der Menge an OHHL wie der Stamm WA-P. Der Überstand von mindestens 107 Yersinien musste extrahiert werden, um OHHL detektieren zu können. Erstmalig wurde aus Yersinia-infiziertem Mausgewebe (Leber, Milz und Peyer Plaques) und aus dem Darm und Peritoneum HSL isoliert. Für die Detektion im Mausgewebe mussten aus dem jeweiligen Organhomogenat mindestens 108 Yersinien isoliert werden. Auf welchem Wege (oral, i.v. oder i.p.) die Mäuse mit den Yersinien infiziert wurden, hatte keinen Einfluss auf die OHHL-Menge im Gewebe. Es gelang mit einer neuartigen Rekombinationsmethode, dem „Red-vermittelten Genaustausch“, eine yenR-Mutante wie auch eine yenR/yenI-Doppelmutante herzustellen. Virulenztests mit den Mutanten zeigten eine Attenuierung der yenR-Mutante, während die yenR/yenI-Doppelmutante ähnlich virulent war wie der Wildtyp. Die Proteome der Yen-Mutanten wurden mittels 2D-SDS-PAGE mit denen des Mutterstammes verglichen. Dabei wurden vier differentiell produzierte YenR/YenI-abhängige Proteine identifiziert, die am Energiestoffwechsel beteiligt sind und in der Doppelmutante vermehrt synthetisiert wurden. Da QS in der Doppelmutante nicht stattfinden kann, könnte der Weg zum Übergang in die stationäre Phase versperrt sein. In der Folge werden weiterhin Stoffwechselgene exprimiert. Diese Ergebnisse müssen allerdings noch durch Komplementierungsexperimente überprüft werden. Es wurde ebenso die Degradation von OHHL durch die Laktonase AiiA in Yersinien untersucht. Es wurde AiiA sowohl rekombinant hergestellt, wie auch Fusionsproteine konstruiert. Behandlung der Überstände von Yersinien mit AiiA führte erwartungsgemäß zu einer Degradation von OHHL. Einen ähnlichen Effekt konnte auch bei Yersinien beobachtet werden, die ein YopE-AiiA Fusionsprotein produzierten. AiiA ist ein Beispiel für ein neuartiges Antiinfektivum.
Quorum Sensing Yersinia enterocolitica
Jacobi, Christoph
2006
Deutsch
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Jacobi, Christoph (2006): Charakterisierung des Quorum Sensings in Yersinia enterocolitica unter Kultur- und Infektionsbedingungen. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

In dieser Arbeit wurde Quorum Sensing (QS) in dem mauspathogenen Bakterium Yersinia enterocolitica WA-P Serogruppe 08 in vitro und im Mausinfektionsmodell untersucht. QS beschreibt das Phänomen, welches Einzelbakterien erlaubt, die Anzahl der Bakterien innerhalb einer Population über die Konzentration von Signalmolekülen zu messen. Der untersuchte Stamm synthetisiert lediglich das N-(3-Oxohexanoyl)-Homoserinlakton (OHHL) als Signalmolekül, während Yersinien anderer Serogruppen über ein weiteres Homoserinlakton (HHL) verfügen. Es wurde gezeigt, dass die OHHL-Produktion von den Wachstumsbedingungen abhängt aber auch stammspezifisch sein kann. So synthetisierte der Stamm 8081 der gleichen Serogruppe 08 unter vergleichbaren Wachstumsbedingungen nur 1/10 der Menge an OHHL wie der Stamm WA-P. Der Überstand von mindestens 107 Yersinien musste extrahiert werden, um OHHL detektieren zu können. Erstmalig wurde aus Yersinia-infiziertem Mausgewebe (Leber, Milz und Peyer Plaques) und aus dem Darm und Peritoneum HSL isoliert. Für die Detektion im Mausgewebe mussten aus dem jeweiligen Organhomogenat mindestens 108 Yersinien isoliert werden. Auf welchem Wege (oral, i.v. oder i.p.) die Mäuse mit den Yersinien infiziert wurden, hatte keinen Einfluss auf die OHHL-Menge im Gewebe. Es gelang mit einer neuartigen Rekombinationsmethode, dem „Red-vermittelten Genaustausch“, eine yenR-Mutante wie auch eine yenR/yenI-Doppelmutante herzustellen. Virulenztests mit den Mutanten zeigten eine Attenuierung der yenR-Mutante, während die yenR/yenI-Doppelmutante ähnlich virulent war wie der Wildtyp. Die Proteome der Yen-Mutanten wurden mittels 2D-SDS-PAGE mit denen des Mutterstammes verglichen. Dabei wurden vier differentiell produzierte YenR/YenI-abhängige Proteine identifiziert, die am Energiestoffwechsel beteiligt sind und in der Doppelmutante vermehrt synthetisiert wurden. Da QS in der Doppelmutante nicht stattfinden kann, könnte der Weg zum Übergang in die stationäre Phase versperrt sein. In der Folge werden weiterhin Stoffwechselgene exprimiert. Diese Ergebnisse müssen allerdings noch durch Komplementierungsexperimente überprüft werden. Es wurde ebenso die Degradation von OHHL durch die Laktonase AiiA in Yersinien untersucht. Es wurde AiiA sowohl rekombinant hergestellt, wie auch Fusionsproteine konstruiert. Behandlung der Überstände von Yersinien mit AiiA führte erwartungsgemäß zu einer Degradation von OHHL. Einen ähnlichen Effekt konnte auch bei Yersinien beobachtet werden, die ein YopE-AiiA Fusionsprotein produzierten. AiiA ist ein Beispiel für ein neuartiges Antiinfektivum.