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Optimierung einer Methode zum Nachweis von p53-Mutationen in der Kolonlavage bei kolorektalen Neoplasien
Optimierung einer Methode zum Nachweis von p53-Mutationen in der Kolonlavage bei kolorektalen Neoplasien
Das kolorektale Karzinom ist die zweithäufigste Todesursache durch maligne Tumoren in den Industrienationen, verantwortlich für mehr als 10 % aller Krebstoten, mit zunehmender Inzidenz. Eine Heilung verspricht nur die chirurgische Intervention im Frühstadium, die Prognose in fortgeschrittenen Krankheitsstadien ist meist schlecht. Die Entdeckung der genetischen Veränderungen während der Tumorgenese kolorektaler Tumoren lässt hoffen, dass eine Früherkennung dieser ernsten Erkrankung über den Nachweis bestimmter Genmutationen im Stuhl oder der Kolonlavageflüssigkeit möglich ist. Die dabei am häufigsten auftretenden Mutationen betreffen das p53-Tumorsuppressorgen. Ziel dieser Arbeit war die Optimierung einer Methode zum Nachweis von p53 Mutationen in Kolonlavageproben. Mit Hilfe einer „Single Strand Conformation Polymorphism“ – Analyse war ein einfaches Screening der Exons 5-8 des p53-Gens möglich. Für die Etablierung dieser SSCP-Analyse und als positiv Kontrolle dienten die Zelllinien SW480, HaCat, Kle-1B, Hec-1B, Hut 78 und BT-20. Alle Mutationen der Zelllinien ließen sich in der optimierten SSCP-Analyse zweifelsfrei nachweisen. Dabei konnte bezüglich der Sensitivität dieser Methode gezeigt werden, dass ein Anteil von ≥ 20 % mutierter DNA in der Wildtyp-DNA nötig ist, um die Mutation nachzuweisen. Bei 37 Patienten mit kolorektalem Karzinom und einem Patienten mit einem 3 cm großen kolorektalen Adenom wurde eine Koloskopie durchgeführt. Die Tumoren wurden histopathologisch klassifiziert und die Lavageflüssigkeit zur weiteren Analyse gesammelt. Nach der Extraktion der DNA aus den Lavageproben folgten PCR und Reinigung der Amplifikate. Sowohl die Extraktion der DNA als auch die Amplifikation konnte in allen Fällen problemlos durchgeführt werden. P53 Mutationen konnten mit Hilfe der SSCP-Analyse bei 8 (22 %) der Karzinompatienten und bei dem Adenompatienten (100 %) detektiert werden. Es zeigte sich keine Korrelation zwischen dem Tumorstadium und dem Mutationsnachweis. Weiter zeigte sich keine Korrelation zwischen zusätzlich zu den Karzinomen vorhandenen Adenomen und dem Mutationsnachweis. Mit der hier verwendeten Methode ist ein Nachweis von p53 Mutationen in Kolonlavageproben möglich. Es konnten Mutationen sowohl in einem prämalignen Stadium als auch bei kleinen, auf Mukosa und Submukosa beschränkten, Karzinomen nachgewiesen werden. Der Mutationsnachweis gelang bei Tumoren aus allen Kolonabschnitten. Dennoch ist die Sensitivität der hier vorgestellten Methode zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht ausreichend. Weitere Studien werden benötigt, um die Sensitivität beispielsweise durch DNA-Anreicherungsmethoden zu erhöhen.
p53,SSCP,Kolonkarzinom,Kolonlavage,Zelllinien
Braun, Michael
2005
Deutsch
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Braun, Michael (2005): Optimierung einer Methode zum Nachweis von p53-Mutationen in der Kolonlavage bei kolorektalen Neoplasien. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Das kolorektale Karzinom ist die zweithäufigste Todesursache durch maligne Tumoren in den Industrienationen, verantwortlich für mehr als 10 % aller Krebstoten, mit zunehmender Inzidenz. Eine Heilung verspricht nur die chirurgische Intervention im Frühstadium, die Prognose in fortgeschrittenen Krankheitsstadien ist meist schlecht. Die Entdeckung der genetischen Veränderungen während der Tumorgenese kolorektaler Tumoren lässt hoffen, dass eine Früherkennung dieser ernsten Erkrankung über den Nachweis bestimmter Genmutationen im Stuhl oder der Kolonlavageflüssigkeit möglich ist. Die dabei am häufigsten auftretenden Mutationen betreffen das p53-Tumorsuppressorgen. Ziel dieser Arbeit war die Optimierung einer Methode zum Nachweis von p53 Mutationen in Kolonlavageproben. Mit Hilfe einer „Single Strand Conformation Polymorphism“ – Analyse war ein einfaches Screening der Exons 5-8 des p53-Gens möglich. Für die Etablierung dieser SSCP-Analyse und als positiv Kontrolle dienten die Zelllinien SW480, HaCat, Kle-1B, Hec-1B, Hut 78 und BT-20. Alle Mutationen der Zelllinien ließen sich in der optimierten SSCP-Analyse zweifelsfrei nachweisen. Dabei konnte bezüglich der Sensitivität dieser Methode gezeigt werden, dass ein Anteil von ≥ 20 % mutierter DNA in der Wildtyp-DNA nötig ist, um die Mutation nachzuweisen. Bei 37 Patienten mit kolorektalem Karzinom und einem Patienten mit einem 3 cm großen kolorektalen Adenom wurde eine Koloskopie durchgeführt. Die Tumoren wurden histopathologisch klassifiziert und die Lavageflüssigkeit zur weiteren Analyse gesammelt. Nach der Extraktion der DNA aus den Lavageproben folgten PCR und Reinigung der Amplifikate. Sowohl die Extraktion der DNA als auch die Amplifikation konnte in allen Fällen problemlos durchgeführt werden. P53 Mutationen konnten mit Hilfe der SSCP-Analyse bei 8 (22 %) der Karzinompatienten und bei dem Adenompatienten (100 %) detektiert werden. Es zeigte sich keine Korrelation zwischen dem Tumorstadium und dem Mutationsnachweis. Weiter zeigte sich keine Korrelation zwischen zusätzlich zu den Karzinomen vorhandenen Adenomen und dem Mutationsnachweis. Mit der hier verwendeten Methode ist ein Nachweis von p53 Mutationen in Kolonlavageproben möglich. Es konnten Mutationen sowohl in einem prämalignen Stadium als auch bei kleinen, auf Mukosa und Submukosa beschränkten, Karzinomen nachgewiesen werden. Der Mutationsnachweis gelang bei Tumoren aus allen Kolonabschnitten. Dennoch ist die Sensitivität der hier vorgestellten Methode zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht ausreichend. Weitere Studien werden benötigt, um die Sensitivität beispielsweise durch DNA-Anreicherungsmethoden zu erhöhen.