Dissecting the role of ISW1a in preventing cryptic transcription

Almeida, Andreia (2026): Dissecting the role of ISW1a in preventing cryptic transcription. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Eukaryotic genomes are organized into chromatin, comprising nucleosomes that wrap DNA around an octamer of canonical histones (H2A, H2B, H3, and H4). The SWR1 complex (SWR1C) is responsible for H2A/H2A.Z exchange at the +1 nucleosome in yeast. H2A.Z-containing nucleosomes are less stable, facilitating disassembly and therefore RNA polymerase II (RNAPII) access during transcription initiation. In Saccharomyces cerevisiae, Isw1 and Chd1 chromatin remodelers space nucleosomes into organized arrays. Isw1 acts as the ATPase subunit of Isw1a (Isw1/Ioc3) and Isw1b (Isw1/Ioc2/Ioc4) complexes, which differ in their subunit composition. Loss of Isw1, combined with CHD1 deletion, enhances cryptic intragenic transcription. However, the specific roles of Isw1, Chd1, and ISW1a in controlling cryptic transcription remain unexplored. Herein, I used RNA-seq and 5′ cap-seq to dissect the extent of the cryptic phenotype in the isw1Δ chd1Δ double mutant and to determine the individual contributions of CHD1 and ISW1a to cryptic transcription. I then integrated ChIP-seq data with transcriptomic analyses and performed multiplexed RT-qPCR, CUT&RUN, and ChIP-qPCR experiments to elucidate the mechanism through which ISW1a prevents cryptic transcription in yeast. Deleting both Isw1 and Chd1 resulted in a significant increase in cryptic transcription, with 35% of yeast genes exhibiting elevated antisense RNA (asRNA) expression and 698 genes showing increased sense transcription. I identified 1,918 antisense RNAs in the isw1Δ chd1Δ double mutant, most of which were capped and polyadenylated. Longer genes were particularly susceptible to harboring these cryptic transcripts. ISW1a and CHD1 exhibited distinct and complementary roles in suppressing antisense transcription. CHD1 primarily represses antisense transcription at 3′ ends of genes, initiating near transcription end sites, whereas ISW1a suppresses antisense transcription initiation at 5′ ends of genes. Additionally, ISW1a may prevent divergent transcription from intergenic regions, including production of nuclear exosome–degraded cryptic unstable transcripts. ISW1a and CHD1 also differentially impact sense transcription: ISW1a suppresses intragenic sense transcription initiation, preventing accumulation of cryptic transcripts in mid-to-late gene regions, while CHD1 represses both intragenic regions and gene promoters, thereby affecting cryptic and mRNA transcription. In all remodeler mutants, derepressed antisense transcription was enriched in genes related to transmembrane transport, whereas derepressed sense transcription was associated with sporulation genes, highlighting the dependence of these loci on chromatin structure for transcription fidelity. This work reveals an association between altered chromatin composition and cryptic transcription in isw1Δ and ioc3Δ cells, as elevated H2A.Z levels overlapped with cryptic transcription start sites. Additional deletion of HTZ1 (encoding yeast H2A.Z) suppressed antisense transcription in these mutants, underscoring the importance of H2A.Z in cryptic transcription initiation. A similar suppression was observed in a swr1Δ background, particularly in isw1Δ cells, suggesting that SWR1C is required for H2A.Z incorporation at antisense start sites. CUT&RUN experiments targeting Flag-tagged Ioc3 confirmed recruitment of Ioc3 to gene boundaries in wild-type yeast. Prior in vitro findings from our laboratory demonstrated that ISW1a preferentially binds H2A.Z-containing nucleosomes and slides them more rapidly than H2A-containing nucleosomes. Follow-up ChIP-qPCR experiments support this observation, showing reduced Ioc3 occupancy at gene starts upon HTZ1 deletion, indicating that H2A.Z partially contributes to ISW1a recruitment in vivo. I propose a model in which loss of ISW1a destabilizes chromatin, particularly at gene 5′ ends, exposing DNA regions that recruit SWR1C and promote intragenic H2A.Z incorporation. This incorporation weakens histone–DNA contacts, facilitating RNAPII-mediated cryptic transcription. Together, these findings provide novel insight into the distinct yet cooperative roles of ISW1a and CHD1 in maintaining transcription fidelity.

Abstract

Eukaryotische Genome sind in Chromatin organisiert, das aus Nukleosomen besteht, die DNA um ein Oktamer aus kanonischen Histonen (H2A, H2B, H3 und H4) wickeln. Der SWR1-Komplex (SWR1C) ist für den Austausch von H2A gegen H2A.Z im +1-Nukleosom in Hefe verantwortlich. H2A.Z-haltige Nukleosomen sind weniger stabil, was die Disassemblierung erleichtert und somit der RNA-Polymerase II (RNAPII) während der Transkriptionsinitiation Zugang verschafft. In Saccharomyces cerevisiae positionieren die Chromatin-Remodeler Isw1 und Chd1 die Nukleosomen in geordneten Arrays. Isw1 fungiert als ATPase-Untereinheit der Isw1a- (Isw1/Ioc3) und Isw1b- (Isw1/Ioc2/Ioc4) Komplexe, die sich in ihrer Untereinheitenzusammensetzung unterscheiden. Der Verlust von Isw1, kombiniert mit der Deletion von CHD1, verstärkt die kryptische intragene Transkription. Die spezifischen Rollen von Isw1, Chd1 und ISW1a bei der Kontrolle kryptischer Transkription sind jedoch bislang unerforscht. In dieser Arbeit habe ich RNA-seq und 5′ cap-seq eingesetzt, um das Ausmaß des kryptischen Phänotyps in isw1Δ chd1Δ-Doppelmutanten zu untersuchen und die individuellen Beiträge von CHD1 und ISW1a zur kryptischen Transkription zu bestimmen. Anschließend integrierte ich ChIP-seq-Daten mit meinen Transkriptomdaten und führte Multiplex-RT-qPCR-, CUT&RUN- sowie ChIP-qPCR-Experimente durch, um den Mechanismus aufzuklären, durch den ISW1a die kryptische Transkription in Hefe verhindert. Die Deletion von Isw1 und Chd1 führte zu einem signifikanten Anstieg kryptischer Transkription, wobei 35 % der Hefegene eine erhöhte Expression von antisense-RNAs (asRNAs) und 698 Gene eine gesteigerte sense-Transkription zeigten. Insgesamt identifizierte ich 1.918 antisense-RNAs in der isw1Δ chd1Δ-Doppelmutante, die überwiegend gekappt und polyadenyliert waren. Längere Gene erwiesen sich als besonders anfällig für das Auftreten dieser kryptischen Transkripte. ISW1a und CHD1 zeigten unterschiedliche, sich jedoch ergänzende Rollen bei der Unterdrückung der antisense-Transkription. CHD1 reprimiert antisense-Transkription hauptsächlich an den 3′-Enden von Genen, wo sie in der Nähe der Transkriptionsendstellen initiiert, während ISW1a die Initiation der antisense-Transkription an den 5′-Enden der Gene verhindert. Darüber hinaus identifizierte ich eine potenzielle Rolle von ISW1a bei der Verhinderung divergenter Transkription in intergenen Regionen, einschließlich der Produktion nuklearer, vom Exosom abgebauter kryptisch instabiler Transkripte. Zusätzlich zeigte sich, dass ISW1a und CHD1 die sense-Transkription unterschiedlich beeinflussen. ISW1a unterdrückt die Initiation der sense-Transkription in intragenen Regionen und verhindert so die Ansammlung kryptischer Transkripte in mittleren bis endständigen Genbereichen. CHD1 reprimiert sowohl intragene Bereiche als auch Genpromotoren und beeinflusst dadurch sowohl kryptische als auch mRNA-Transkription. In allen Remodeler-Mutanten war deregulierte antisense-Transkription in Genen angereichert, die mit transmembranem Transport assoziiert sind, während deregulierte sense-Transkription mit Genen der Sporulation verbunden war. Dies unterstreicht die entscheidende Abhängigkeit dieser Gene von der Chromatinstruktur für eine präzise Transkriptionsregulation. Die hier vorgestellten Arbeiten zeigen einen Zusammenhang zwischen Veränderungen der Chromatinzusammensetzung und kryptischer Transkription in isw1Δ- und ioc3Δ-Zellen, da erhöhte H2A.Z-Werte mit dem Beginn kryptischer Transkripte überlappten. Die zusätzliche Deletion von HTZ1 (kodierend für Hefe-H2A.Z) unterdrückte die antisense-Transkription in diesen Mutanten und hob die Bedeutung von H2A.Z bei der Initiation kryptischer Transkription hervor. Eine ähnliche Unterdrückung wurde in einem swr1Δ-Hintergrund beobachtet, insbesondere in isw1Δ-Zellen, was darauf hindeutet, dass SWR1C für die H2A.Z-Inkorporation am Beginn kryptischer Transkripte erforderlich sein könnte. CUT&RUN-Experimente mit Flag-markiertem Ioc3 bestätigten frühere Befunde und zeigten die Rekrutierung von Ioc3 an Gen-Grenzen in Wildtyp-Hefe. Frühere in-vitro-Ergebnisse aus unserem Labor zeigten, dass ISW1a bevorzugt an H2A.Z-haltige Nukleosomen bindet und diese schneller verschiebt als H2A-haltige Nukleosomen. Meine anschließenden ChIP-qPCR-Experimente stützen diese Beobachtung, da sie eine verringerte Ioc3-Besetzung am Beginn von Genen nach der Deletion von HTZ1 zeigten. Dies deutet darauf hin, dass H2A.Z teilweise zur Rekrutierung von ISW1a an diese Regionen in vivo beiträgt. Ich schlage einen Mechanismus vor, bei dem der Verlust von ISW1a das Chromatin insbesondere an den 5′-Enden von Genen destabilisiert und DNA-Bereiche freilegt, die SWR1C rekrutieren könnten, was zu einer intragenen H2A.Z-Inkorporation in diesen Regionen führt. Dadurch werden Histon-DNA-Kontakte geschwächt und die RNAPII-vermittelte kryptische Transkription erleichtert. Insgesamt liefern meine Ergebnisse neue Einblicke in die unterschiedlichen, jedoch kooperativen Rollen von ISW1a und CHD1 bei der Aufrechterhaltung der Transkriptionsgenauigkeit.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: ISWI, ISW1a, Saccharomyces cerevisiae, chromatin remodeling, chromatin, noncoding transcription, H2A.Z, cryptic transcription, CHD1
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 3. Februar 2026
• 1. Bericht­erstatter:in: Ladurner, Andreas