Connectomic analyses of songbird Area X

Rother, Alexandra (2026): Connectomic analyses of songbird Area X. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie

Abstract

Connectomics is a field dedicated to the high-resolution analysis of neural circuits. Making use of nanometer scale resolution provided by volume electron microscopy (EM), analysis allows information on the level of individual synapses and other subcellular structures. This thesis presents a comprehensive analysis of a connectomic dataset from the songbird brain, specifically Area X—a nucleus involved in song learning and part of the avian basal ganglia. The work includes improvements to the processing pipeline, morphological characterization of neurons and glia, and detailed analyses of synaptic connectivity and subcellular organelles. To facilitate this analysis, the existing EM data processing pipeline was extended to include classification of glial cells, migratory neurons, and three newly described GABAergic interneurons. Additionally, to enable analysis of further subcellular structures, the endoplasmic reticulum (ER), the Golgi apparatus (GA), and individual synaptic vesicles were predicted. This culminated in the first dataset that, alongside dense reconstructions of over 8,500 neurons, includes densely segmented synapses, mitochondria, ER, GA, and individual vesicles. Mitochondria, vesicles and axonal ER densities were found to correlate with known firing rates and help to bridge information between EM and functional methods. The dataset provides the first connectomic overview of basal ganglia circuitry in any species. Analyses revealed analogues of the direct, indirect, and hyperdirect pathways. In terms of synaptic connectivity, the direct pathway is the strongest pathway through Area X, while the hyperdirect pathway appears to be its strongest antagonist. The indirect pathway is poorly segregated from the direct pathway and also weak in terms of synaptic connectivity. Since one cell type of the indirect pathway, the GPe, is more involved in a feedback loop with novel GABAergic interneurons, the results challenge the idea of basal ganglia connectivity being mainly in the form of feedforward pathways. As not all cell types transmit information via synaptic transmission, individual vesicles were used to further analyze the possibility of volume transmission. The presence of vesicles outside synaptic loci was common in cholinergic and dopaminergic axons, consistent with their reported use of volume transmission and their surroundings were in line with a global signal. Finally, dense reconstructions of glial cells and migratory neurons allowed for organelle-level comparisons, providing insight into their metabolic demands. To highlight their role in neuronal plasticity, contact sites with neurons were analyzed as a first proxy for neuron-glia interactions. In summary, this thesis presents the first dense connectomic analysis of an avian basal ganglia nucleus, integrating synaptic, morphological, and subcellular data. These findings not only provide new insights into the structure and function of Area X and into connectivity within the vertebrate basal ganglia, but also demonstrate how extending connectomic pipelines to include organelles and non-neuronal cells can unlock richer biological interpretations from EM datasets.

Abstract

Das Forschungsfeld der Konnektomik beschäftigt sich mit der Analyse neuronaler Schaltkreise basierend auf Daten aus der volumetrischen Elektronenmikroskopie (EM). Diese ermöglicht eine Auflösung im Nanometerbereich und damit die Untersuchung auf der Ebene einzelner Synapsen und subzellulärer Strukturen. Diese Arbeit präsentiert eine umfassende Analyse eines konnektomischen Datensatzes aus dem Gehirn des Zebrafinken, speziell aus Area X – einem Hirnareal, das für das Erlernen von Gesang notwendig und Teil der avianen Basalganglien ist. Die Arbeit umfasst Verbesserungen der Datenverarbeitungspipeline, die morphologische Charakterisierung von Neuronen und Gliazellen sowie detaillierte Analysen der synaptischen Konnektivität und subzellulärer Organellen. Zur Durchführung dieser Analyse wurde die bestehende EM-Verarbeitungspipeline erweitert, um die Klassifikation von Gliazellen, migrierenden Neuronen und drei neu identifizierten GABAergen Interneurontypen zu ermöglichen. Um Informationen von weiteren subzellulären Strukturen analysieren zu können, wurden auch das endoplasmatische Retikulum (ER), der Golgi-Apparat (GA) und einzelne synaptische Vesikel vorhergesagt. Das Ergebnis ist der erste Datensatz, der neben der dichten Rekonstruktion von über 8.500 Neuronen auch die vollständige Segmentierung von Synapsen, Mitochondrien, ER, GA und Vesikeln umfasst. Die Dichten von Mitochondrien, Vesikeln und axonalem ER korrelierten mit bekannten Feuerraten und können damit die Lücke zwischen EM-Daten und funktionellen Methoden weiter schließen. Der Datensatz bietet erstmals einen umfassenden konnektomischen Überblick über die Verschaltung der Basalganglien. Analysen identifizierten Analoga der direkten, indirekten und hyperdirekten Signalwege. Der direkte Weg stellt den stärksten Verschaltungsweg durch Area X dar, während der hyperdirekte Weg als ihr stärkster Antagonist fungiert. Der indirekte Weg war nur schwach ausgeprägt und nicht klar von dem direkten getrennt. Da ein Zelltyp des indirekten Signalwegs, GPe, vor allem in Rückkopplungsschleifen mit den neu beschriebenen Interneuronen eingebunden ist, stellen diese Ergebnisse die klassische Vorstellung von vornehmlich vorwärts-organisierten Signalwegen in den Basalganglien in Frage. Da nicht alle Zelltypen Informationen ausschließlich über synaptische Übertragung weitergeben, wurden einzelne Vesikel genutzt, um mögliche volumenbasierte Übertragungsmechanismen zu untersuchen. Vesikel außerhalb von Synapsen waren insbesondere in cholinergen und dopaminergen Axonen häufig, was zu ihrer vermuteten Rolle in der Volumenübertragung passen würde. Zelltypen und Synapsen in der Umgebung der Vesikel außerhalb der Synapsen waren entsprechend ihrer Häufigkeit im Datensatz vertreten, was auf ein global wirkendes Signal hindeutet. Abschließend ermöglichten die dichten Rekonstruktionen von Gliazellen und migrierenden Neuronen erstmals organellbasierte Vergleiche, die Rückschlüsse auf den Energiebedarf dieser Zelltypen zulassen. Um ihre Rolle in der neuronalen Plastizität zu beleuchten, wurden Kontaktflächen mit Neuronen als erster Proxy für neuron-gliale Interaktionen analysiert. Zusammenfassend präsentiert diese Arbeit die erste konnektomische Analyse eines avianen Basalganglien Kerns, in der synaptische, morphologische und subzelluläre Daten integriert wurden. Die Ergebnisse liefern neue Einblicke in die Struktur und Funktion von Area X sowie in die Konnektivität der Basalganglien bei Wirbeltieren und zeigen, wie die Einbindung von Organellen und nicht-neuronalen Zelltypen die Aussagekraft von EM-Datensätzen erweitern kann.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: connectomics, songbird, neurobiology, basal ganglia
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
• Fakultäten: Fakultät für Biologie
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 13. Januar 2026
• 1. Bericht­erstatter:in: Grothe, Benedikt