Double drop-off droplet digital PCR (DDO-ddPCR): a novel, versatile tool for mutation screening and residual disease monitoring in AML using cellular or cell-free DNA

Rausch, Christian (2025): Double drop-off droplet digital PCR (DDO-ddPCR): a novel, versatile tool for mutation screening and residual disease monitoring in AML using cellular or cell-free DNA. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Acute myeloid leukemia (AML) is a clonal disorder of precursor cells of the myeloid blood cell lineage. The disease course is defined by genetic aberrations accumulated in hematopoietic stem and progenitor cells. Therefore, these genetic changes can also be used for risk stratification at diagnosis. If antileukemic therapy successfully eradicated the leukemic cells, these aberrations should no longer be detectable. If some leukemic cells persist, however, these alterations are still detectable at a low level using very sensitive assays. This phenomenon is called measurable residual disease (MRD). It is highly prognostically significant, as its detection signals insufficient eradication of leukemic cells which often results in disease relapse. Therefore, robust, sensitive, and fast molecular genetic assays for MRD-monitoring are needed for clinical use. Currently the most common methods for MRD-monitoring are multiparameter flow cytometry (MFC) and quantitative real-time PCR (RT-qPCR). While MFC is broadly established and applicable in most AML, its sensitivity is generally lower than that of molecular genetic approaches. Though qPCR currently represents the most sensitive option, its use is only well evaluated for few targets, limiting its applicability. It also requires external reference standards for quantification of MRD levels. Next-generation-sequencing (NGS) could potentially be applied more broadly as variants in any leukemia-associated gene can potentially be detected ensuring a trackable target in virtually any patient but is generally more expensive and less sensitive. One investigational approach to overcoming these limitations is droplet digital PCR (ddPCR). Here, a sample is split into nanoliter-sized droplets which undergo PCR individually and which can then each be assessed for amplification of a target using fluorescent reporter probes. It is cheaper and more sensitive than NGS-based solutions and abolishes the need for external reference standards present with qPCR. However, commercially available assays only detect individual nucleotide exchanges. Therefore, we developed double drop-off digital droplet PCR (DDO-ddPCR) assays, which can quantitatively detect diverse alterations at two neighboring hotspot regions present in AML-associated genes (NPM1, IDH2 and NRAS). These assays can be used for screening, quantification and monitoring. The assays were compared to existing ddPCR assays and next-generation sequencing and achieved high concordance as well as similar sensitivity as conventional ddPCR. We also evaluated whether peripheral blood cell-free DNA (cfDNA) of AML patients was a viable substrate for MRD monitoring by DDO-ddPCR. We found that cfDNA-based analyses are as sensitive as conventional MRD-assays using qPCR of peripheral blood mononuclear cell cDNA. Furthermore, there are multiple clinical scenarios in which cfDNA-based mutation detection may be beneficial. Early response assessment during induction chemotherapy, long-term monitoring of targeted therapies, and detection of alterations found in extramedullary AML manifestations which are not easily amenable to biopsy are feasible using this approach. We were already able to publish these findings.1,3 Thus, DDO-ddPCR based cfDNA analysis can complement routinely used molecular genetic assays for AML diagnostics.

Abstract

Die akute myeloische Leukämie (AML) ist eine klonale Störung der Vorläuferzellen der myeloischen Blutzellreihe. Genetische Aberrationen, die sich in leukämischen Stammzellen ansammeln, definieren den Krankheitsverlauf. Daher werden sie auch zur Risikostratifikation herangezogen. Nach erfolgreicher Therapie der Erkrankung sollten keine AML-typischen genetischen oder immunphänotypischen Aberrationen mehr nachweisbar sein. Wenn jedoch einige leukämische Zellen persistieren, sind diese Veränderungen mit sehr sensitiven Assays weiterhin ach-weisbar. Dieses Phänomen wird als messbare Resterkrankung (MRD) bezeichnet. Die MRD hat eine hohe prognostische Bedeutung, da ihr Nachweis auf residuelle leukämische Zellen hinweist, welche Ausgangspunkt für ein Erkrankungsrezidiv sein können. Daher sind für den klinischen Einsatz robuste, sensitive und schnelle diagnostische Assays zur MRD-Überwachung erforderlich. Die aktuellen Techniken zur Mutationsanalyse und -quantifizierung weisen Schwächen auf, die einen Bedarf an neuen diagnostischen Tests offenlassen. Derzeit sind die gängigsten Methoden zum MRD-Monitoring die multiparametrische Durchflusszytometrie (MFC) und die quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR). Obwohl MFC weit verbreitet und in den meisten Fällen anwendbar ist, ist die Sensitivität im Allgemeinen geringer als bei molekulargenetischen Ansätzen. Während die qPCR derzeit die sensitivste Option darstellt, ist ihre Anwendung nur für wenige Ziele (mutierte Gene) gut evaluiert. Sie benötigt außerdem externe Referenzstandards zur Quantifizierung der MRD-Niveaus. Next-Generation-Sequencing (NGS) könnte potenziell breiter eingesetzt werden, ist jedoch in der Regel teurer und weniger sensitiv. Ein Ansatz zur Überwindung dieser Einschränkungen ist die Digital-Droplet-PCR (ddPCR). Hier wird eine PCR-Reaktion in nanolitergroße Tröpfchen aufgeteilt, die einzeln die PCR durchlaufen und dann unter Verwendung von fluoreszierenden Reporter-Sonden jeweils auf die Amplifikation eines Ziels überprüft werden. Sie ist kostengünstiger und sensitiver als NGS-basierte Lösungen und beseitigt die Notwendigkeit externer Referenzstandards, die bei qPCR vorhanden ist. Kommerziell erhältliche ddPCR-Assays erfassen jedoch nur einzelne Nukleotidaustausche. In dieser Arbeit, deren Resultate zu großen Teilen bereits publiziert werden konnten1,3 wurden daher sogenannte „double drop-off digital droplet PCR (DDO-ddPCR) assays“ für Mutationen in den Genen NPM1, IDH2 und NRAS entwickelt, die in der Lage sind, alle Alterationen, die an jeweils 2 benachbarten, häufig mutierten Positionen (sog., Hotspots) dieser Gene (NPM1 c.863, c.877; IDH2 c.140 c.172; NRAS c.12/13) vorkommen zu detektieren und zu quantifizieren. Diese Assays sind somit sowohl als Screening-Tools als auch zum seriellen Monitoring der Mutations-last zu gebrauchen. Die Assays wurden durch den Vergleich mit Next-Generation-Sequencing und existierenden qPCR-Assays validiert. Hierbei zeigte sich eine hohe Konkordanz mit existierenden Methoden, sowie eine mit konventionellen digitalen PCR-Assays vergleichbare Sensitivität. Außerdem wurde in der vorliegenden Arbeit die Nutzbarkeit der Asssays zum Mutationsnachweis aus zell-freier DNA aus Blut und Liquor von AML-Patient:innen untersucht. Diese Untersuchungen weisen darauf hin, dass Detektion und Monitoring genetischer Alterationen mit dieser Methode eine vergleichbare Sensitivität wie die etablierte quantitative PCRs aus gDNA peripherer Leukozyten erreicht. Zuletzt wurde die Anwendung der Assays in klinischen Szenarien überprüft. Hierbei konnten wir zeigen, dass langfristiges Monitoring zielgerichteter Therapien, frühzeitige Überprüfung des Therapieanprechens bei intensiver Induktionstherapie, sowie die Detektion molekulargenetischer Veränderungen bei Patient:innen mit extramedullären Formen der AML mit unserer Methode möglich sind. Daher ist die cfDNA-basierte DDO-ddPCR eine wertvolle Erweiterung des diagnostischen Repertoires für Diagnose und Monitoring der AML

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: AML, MRD, ddPCR
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 27. November 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Metzeler, Klaus