Foundations for pro-resolution target discovery

Pfanner, Tamara (2025): Foundations for pro-resolution target discovery: integrating human macrophage phenotypic and functional diversity in homeostasis and immune-mediated inflammatory diseases. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Hintergrund Die Remission bzw. das Abklingen von Entzündungen ist ein aktiver und regulierter Prozess, der nach einem akuten Entzündungsreiz die Gewebehomöostase wiederherstellt. Bei immunvermittelten entzündlichen Erkrankungen (IMIDs), wie der rheumatoiden Arthritis (RA), ist die Remission von Entzündungen entweder intrinsisch gestört oder wird durch eine übermäßige entzündliche und immunologische Reaktion auf körpereigene Strukturen aus dem Gleichgewicht gebracht, was die Chronizität und das Wiederaufflammen der Entzündung begünstigt. Infolgedessen bleibt eine langfristige Remission bei IMIDs größtenteils unerreichbar. Die therapeutische Förderung pro-resolutiver Antworten durch pro-resolutive Wirkstoffe könnte die Remissionserhaltung und den Gewebeschutz bei IMIDs unterstützen. Makrophagen (Mφ) gehören zu den zentralen Zelltypen, die die pro-resolutiven Gewebereaktionen während der Entzündung koordinieren. Einzelzell-RNA-Sequenzierungen haben unser Verständnis der transkriptionellen Vielfalt menschlicher Gewebemakrophagen in Homöostase und Krankheit erweitert. Dennoch bleiben funktionelle Spezialisierungen und pro-resolutive Zielstrukturen in menschlichen Mφ weitgehend spekulativ. Forschungsziele Diese Dissertation adressiert die Wissenslücke in Bezug auf die funktionelle Spezialisierung menschlicher Gewebemakrophagen durch die Entwicklung neuartiger multimodaler Einzelzellmethoden zur detaillierten Charakterisierung von Mφ-Phänotypen und -Funktionen in Gesundheit und Krankheit. Darüber hinaus werden in vitro Mφ-Modelle und funktionelle Analyseverfahren entwickelt, um Mφ-assoziierte Zielstrukturen für die Entwicklung pro-resolutiver Wirkstoffe zu identifizieren. Hypothesen Die Entwicklung integrierter Phänotyp-Funktion-Assays ermöglicht die Charakterisierung menschlicher Mφ-Funktionen in Gesundheit und Krankheit und hilft dabei, potenzielle Mφ-Zielstrukturen für pro-resolutive Wirkstoffentwicklungen bei IMIDs zu identifizieren. Verschiedene in vitro Mφ-Modelle zeigen unterschiedliche Fähigkeiten zur Efferozytose und Eisenverwertung, was ihre Eignung für Gain- und Loss-of-Function-Studien zur Identifizierung pro-resolutiver Mφ-Zielstrukturen definiert. Menschliche Gewebe-Mφ-Subtypen unterscheiden sich in ihrer Kapazität zur Efferozytose und Eisenverwertung, was ihre Rolle bei Entzündung und dessen Abklingen in IMIDs beeinflusst. Methoden Ich habe skalierbare in vitro Mφ-Plattformen etabliert und charakterisiert, darunter iPSC-abgeleitete und monozyten-abgeleitete Mφ-Modelle. Ich habe multimodale Phänotyp-Funktion-Mφ-Assays entwickelt, die spektrale Durchflusszytometrie mit mehr als 25 Oberflächenmarkern und drei funktionellen Ausleseverfahren kombinieren. Funktionelle Daten wurden zusätzlich mittels konfokaler Mikroskopie validiert. Primäre humane Mφ, isoliert aus Synovialgewebe und -flüssigkeit von Patienten mit aktiver bzw. remissionärer entzündlicher Arthritis, wurden mittels CITE-Sequenzierung und Phänotyp-Funktions-Analysen durch spektrale Durchflusszytometrie charakterisiert. Ergebnisse Der neu entwickelte Discoverer Mφ Assay ermöglichte eine robuste gleichzeitige Analyse von Mφ-Oberflächenmarkern und -Funktionen, einschließlich Efferozytose, Phagozytose und Eisenverwertung. Die Funktionsausleseparameter, z. B. Efferozytose, wurden über verschiedene experimentelle Bedingungen (z. B. unterschiedliche Inkubationszeiten, Zellverhältnisse, Inhibitorbehandlungen) und Mφ-Typen hinweg validiert und ermöglichten die Bestimmung optimaler Bedingungen für die Charakterisierung von Gewebe-Mφ sowie für funktionelle CRISPR-/Toolmolekül-Screenings. Mit dem Discoverer Mφ Assay konnte ich funktionelle Unterschiede zwischen in vitro Mφ-Modellen nachweisen, was ihre differenzierte Eignung für Gain- und Loss-of-Function-Studien mit Toolmolekülen oder CRISPR-gestützten genetischen Manipulationen verdeutlicht. Beispielsweise zeigten iPSC-differenzierte Mφ eine erhöhte Efferozytose-Kapazität, was sie für Efferozytose Loss-of-Function Studien besonders geeignet macht, während iMicroglia ein geeigneteres Modell für Studien zum Zugewinn von Efferozytose darstellten. Einzelzell-CITE-Seq-Daten aus dem Synovialgewebe zeigten unterschiedliche FOLR2⁺ gewebeständige und CCR2⁺ inflammatorische Mφ-Subtypen. Mithilfe von Discoverer Mφ konnte ich eine variable Anreicherung dieser Mφ-Populationen in Synovialgewebe- und -flüssigkeitsproben von Patienten mit entzündlicher Arthritis nachweisen. Erste Daten zu Phagozytose und Eisenstoffwechsel wiesen auf mögliche subtypspezifische Funktionen synovialer Mφ hin. Die multimodale Integration von Discoverer Mφ mit Transkriptom- und Protein-Daten unterstützt ein verfeinertes Modell der Heterogenität synovialer Mφ und ver-nüpft spezifische Mφ-Subtypen mit Entzündung oder Gewebehomöostase. Fazit In dieser Dissertation habe ich eine neuartige funktionelle Analyseplattform sowie ein Multi-Omics-Analyse-Framework zur Untersuchung der Heterogenität menschlicher Mφ in Homöostase und Krankheit entwickelt. Die entwickelten Methoden stellen ein wertvolles Instrument für die Auswahl geeigneter Mφ-Modelle und funktioneller Ausleseparameter für Screenings mit Toolmolekülen oder genetischen Modifikationen dar. Meine Forschung liefert grundlegende Werkzeuge zur Identifikation und gezielten Ansprache pro-resolutiver Mφ-Subtypen und unterstützt die Entwicklung Mφ-orientierter Therapien bei IMIDs.

Abstract

Background Resolving inflammation is an active and regulated process that restores tissue homeostasis following an acute inflammatory insult. In immune-mediated inflammatory diseases (IMIDs), such as rheumatoid arthritis (RA), the resolution of inflammation is either intrinsically impaired or outbalanced by an excessive inflammatory and immune response to self, fueling the chronicity and relapsing nature of inflammation. Consequently, long-term IMID remission remains largely elusive. Enhancing pro-resolution responses therapeutically with pro-resolution drugs could promote remission maintenance and tissue protection in IMIDs. Mac-rophages (Mφ) are one of the central cell types orchestrating the pro-resolving tissue responses during inflammation. Single-cell RNA-sequencing studies advanced our understanding of transcriptional diversity of human tissue Mφ in homeostasis and disease. Yet, functional specialization and pro-resolution targets in human Mφ remain largely speculative. PhD Thesis Objectives: This PhD thesis addresses the knowledge gap in functional specialization of human tissue Mφ by developing novel single-cell multimodal tools for in-depth characterization of Mφ phenotypes and functions in health and disease. Moreover, in vitro Mφ models and function readouts are developed, facilitating the discovery of Mφ-linked targets for pro-resolution drug development. Hypothesis Developing integrated phenotype-function assays facilitates the characterization of human Mφ functions in health and disease, helping us identify candidate Mφ targets for pro-resolution drug development in IMIDs. Different in vitro Mφ models exhibit distinct efferocytosis and iron recycling abilities, defining their applicability in gain-and-loss of function studies to discovery pro-resolution Mφ targets. Human tissue Mφ subsets differ in efferocytosis and iron recycling capacities, influencing their roles in inflammation and pro-resolution in IMIDs. Methods  I established and characterized scalable in vitro Mφ platforms, including iPSC-derived and monocyte-derived Mφ models. I developed multimodal phenotype-function Mφ assays, employing spectral flow cytometry analyses with over 25 surface markers and three Mφ function readouts. Confocal microscopy was used to validate functional flow cytometry data. Primary human Mφ, isolated from synovial tissue and fluid of patients with active/remission inflammatory arthritis, were characterized using CITE-sequencing and function-phenotype spectral flow cytometry analyses. Results The newly developed Discoverer Mφ Assay enabled robust simultaneous profiling of Mφ surface markers and functions, including efferocytosis, phagocytosis, and iron recycling. The function readouts, e.g., efferocytosis, were validated across multiple experimental conditions (e.g, variable incubation times, cell ratios, inhibitor treatments) and Mφ types, determining optimal conditions for tissue Mφ characterization and functional CRISPR/tool molecule screens. Using Discoverer Mφ, I demonstrated functional divergence of in vitro Mφ models, guiding their differential utility for gain-and-loss-of-function studies with tool molecules/CRISPR-based genetic perturbations. For example, iPSC-derived Mφ showed en-hanced efferocytosis capacity, supporting loss-of-efferocytosis studies with tool molecules, while iMicroglia appeared to be a more suitable model for gain-of-efferocytosis studies. Synovial single-cell CITE-seq data revealed distinct FOLR2⁺ tissue-resident and CCR2⁺ inflammatory Mφ subsets. Using Discoverer Mφ, I demonstrated a variable enrichment of these Mφ populations across synovial tissue and synovial fluid samples from patients with inflammatory arthritis. Pilot phagocytosis and iron metabolism data revealed potential subset-specific synovial Mφ functions. The multi-modal integration of Discoverer Mφ with transcriptomic and protein-level data supports a refined model of synovial Mφ heterogeneity, linking specific Mφ subsets to inflammation or tissue homeostasis. Conclusion In this PhD thesis, I established a novel functional profiling platform and multi-omics analysis framework for dissecting human Mφ heterogeneity in homeostasis and disease. The developed methods represent an invaluable tool for guiding the selection of Mφ models and readouts for function screens using tool molecules or genetic perturbations. My research provides foundational tools for identifying and targeting pro-resolving Mφ subsets and supports the development of Mφ-directed therapies in IMIDs.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Macrophages, immune-mediated inflammatory diseases, integrated function-phenotype macrophage analysis, efferocytosis, iron recycling, inflammation resolution, spectral flow cytometry, single-cell multiomics, CRISPR and tool molecule screening
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 20. November 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Schulz, Christian