Effekte einer komplementmodulierenden Genadditionstherapie im retinalen Ischämie-/ Reperfusionsmodell und Charakterisierung des ABCA4/RDH8-Knockoutmodells in der Maus

Glänzer, Sarah (2025): Effekte einer komplementmodulierenden Genadditionstherapie im retinalen Ischämie-/ Reperfusionsmodell und Charakterisierung des ABCA4/RDH8-Knockoutmodells in der Maus. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Ziel im ersten Teil meiner Doktorarbeit war es, den Erfolg einer adeno-assoziierten (AAV)-gestützten Genadditionstherapie im Rahmen einer retinalen Ischämiesituation im Mausmodell hinsichtlich histomorphologischer Veränderungen der Retina zu untersuchen. Eine gekürzte und funktionell optimierte Version des Komplementmodulators Komplementfaktor H sollte durch intravitreale Injektion lokal in der Retina über ein AAV-Vektorsystem überexprimiert werden und eine Rebalancierung der überschießenden Komplementantwort infolge der Läsion bewirken. Die Limitierung der exogenen Proteinproduktion auf Müllerzellen hatte eine einfachere Applikation, eine effektive Sekretion des Zielproteins miniFH und eine Schonung der sensiblen Neuronen zum Ziel. Zu diesem Zweck wurden Mausaugen 3 und 14 Tage nach Läsion/ Injektion untersucht. Es kamen morphometrische Analysen der Kernzahlen und Schichtdicken der Retina in Kombination mit Zelltodanalysen via TUNEL-Assay zum Einsatz. Immunhistochemische Färbungen gestatteten Einblicke in die Verteilung von Komplementfaktoren innerhalb der Retina und in das Ausmaß der Müllerzellgliose. Durch immunhistochemische Anfärbbarkeit des Aktivierungsmarkers CD68 waren Rückschlüsse auf den Aktivierungszustand von Mikroglia möglich. Über die Färbung gegen den EGFP-Reporter konnte zunächst eine sichere Transduktion von Müllerzellen bestätigt werden, welche über ihre einzigartige Morphologie identifiziert werden konnten. Hinsichtlich der Stress-/Inflammationsmarker GFAP und CD68 zeichnete sich eine ausgeprägte Stresssituation mit starker Gliose bzw. Immunreaktion infolge der Läsion ab. Während der Mikroglia-Aktivierungsmarker CD68 nach 14 Tagen einen deutlichen Rückgang der Immunantwort anzeigte und einen signifikanten Vorteil für die miniFH-Behandlung offenbarte, blieben die GFAP-Level auch nach 14 Tagen hoch und geben Raum für Diskussionen über mögliche Kontaminationen oder immunologische Reaktionen auf den viralen Vektor oder aber eine Müllerzellgliose unabhängig von der Komplementhomöostase. Durch immunhistochemische Färbungen gegen die Komplementfaktoren C3/C3d und CFH konnte ich Veränderungen der qualitativen und quantitativen Verteilung dieser Komplementfaktoren nach der Läsion und Therapie beschreiben. Die C3-Spaltprodukte, welche sich in meiner C3d-Färbung anfärben ließen, zeigten Überlappungen mit den Signalen für den Müllerzellmarker GFAP und schienen in deren Endfüßen zu akkumulieren. Ihr Immunfluoreszenzsignal stieg postischämisch an und ebbte nach 14 Tagen wieder ab, wobei sich Hinweise auf geringere Ablagerungen in den miniFH-Behandlungsgruppen abzeichneten. Ich beobachtete die Co-Lokalisation von Komplementfaktor H und Mikroglia, wobei zum jetzigen Zeitpunkt noch keine Aussagen zu den molekularen Vorgängen der Interaktion gemacht werden können oder sicher ausgeschlossen werden kann, dass es sich nicht auch um mauseigenen Komplementfaktor H handeln könnte. Ein TUNEL-Assay kam zum Einsatz, um das Ausmaß von Apoptose bzw. Zelltod 3 und 14 Tage nach Läsion/ Injektion zu untersuchen. Hier zeigten sich nach 3 Tagen noch sehr aktive Entzündungsvorgänge mit hohen Apoptoseraten, die erst nach 14 Tagen abklangen und leichte Vorteile der Therapie mit miniFH anzeigten. In der Konsequenz der noch lange aktiven Apoptosevorgänge zeigten sich die Vorteile einer Behandlung mit miniFH hinsichtlich retinaler Integrität insbesondere nach 14 Tagen. Morphometrische Analysen offenbarten einen starken Zellverlust infolge der Ischämieperiode für DAPI-positive Zellkerne im Allgemeinen sowie speziell für Ganglienzellen und Amakrinzellen. Für alle untersuchten Zellarten zeigte sich zum 14-Tages-Zeitpunkt eine Tendenz zur Überlegenheit der Behandlung mit miniFH – teils in verbessertem relativem Zellüberleben nach 14 Tagen, aber insbesondere in weniger ausgeprägtem Zellverlust zwischen den beiden Analysezeitpunkten im Vergleich zur untersuchten Kontrollgruppe. Ähnliche Beobachtungen konnte ich auch in der Vermessung der Schichtdicken der plexiformen Schichten der Retina machen. Es lässt sich festhalten, dass die Therapie mit miniFH in den meisten Analysen keinen signifikanten Therapieerfolg erzielen konnte, jedoch vielversprechende und untereinander konsistente Tendenzen zu beobachten waren. In dieser Arbeit konnte daher die erfolgreiche Etablierung eines AAV-vermittelten Überexpressionssystems für einen Komplementmodulator auf histologischer Ebene beschrieben werden, welches die effektive und spezifische Transduktion von Müllerzellen erlaubt und die Akkumulation von C3-Spaltprodukten reduziert. Die miniFH-Genadditionstherapie resultierte in verbessertem Zellüberleben und geringerer Mikroglia-Aktivierung im akuten und relativ schweren Degenerationsmodell retinaler Ischämie/ Reperfusion. Der Einsatz im Ischämie-/ Reperfusionsmodell spiegelt nur eingeschränkt den angedachten Einsatzbereich der Therapie wider. In Zukunft wäre eine weitere Evaluation des Effekts in Modellen sinnvoll, die eine langsame Progression eines Krankheitsverlaufs simulieren, wobei die AAV-Applikation idealerweise frühzeitig vor der Manifestation ausgeprägter retinaler Degeneration erfolgen sollte. Weitere Ansatzpunkte zur Optimierung wären beispielsweise die weitere Anpassung des AAV-Vektors hinsichtlich Effektivität der Müllerzelltransduktion oder die Adaptation der miniFH-Zusammensetzung. Insbesondere eventuelle Manipulationen durch das myc-Tag und seine Detektierbarkeit sollten optimiert werden. Das Degenerationsausmaß könnte ERG-gestützt quantifiziert und Therapieeffekte feiner differenziert werden, da bekannt ist, dass Funktionseinschränkungen lange vor dem eigentlichen Verlust der entsprechenden Zelltypen darstellbar sind. Die limitierte Übertragbarkeit der Ergebnisse vom Mausmodell auf den Menschen sollte zudem ins Auge gefasst werden. Die Daten dieses Projektteils meiner Dissertation sind als zentrales Kernstück zur Validierung des in vivo Therapieeffekts der miniFH-Überexpression in folgendem Manuskript publiziert: Biber J, Jabri Y, Glänzer S, Dort A, Hoffelner P, Schmidt CQ, Bludau O, Pauly D, Grosche A. Gliosis-dependent expression of complement factor H truncated variants attenuates retinal neurodegeneration following ischemic injury. J Neuroinflammation. 2024;21(1):56. doi: 10.1186/s12974-024-03045-3. PMID: 38388518 Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Phänotyp eines ABCA4-/- RDH8-/--Doppel-Knockout-Mausmodells charakterisiert, welcher die retinale Manifestation eines Morbus Stargardt simulieren sollte. Da für den RDH8-/--Single-Knockout keine strukturelle Degeneration bekannt war, wurden Tiere dieses Genotyps als Vergleich zugrunde gelegt. Die Charakterisierung erfolgte anhand der Merkmale der Autofluoreszenz des retinalen Pigmentepithels, der Mikroglia-Aktivierung und struktureller retinaler Integrität im Alter von 4 und 9 Monaten. Im Alter von 4 Monaten war in keinem der untersuchten Parameter ein signifikanter Unterschied zwischen beiden Genotypen zu verzeichnen. In der Messung der RPE-Autofluoreszenz zeigten sich mit der Zeit zunehmende Ablagerungen autofluoreszenten Lipofuszins, was auch ein typisches Charakteristikum des Morbus Stargardt ist. Die Autofluoreszenzwerte korrelierten positiv mit der Stärke der Lichtexposition und waren bei ABCA4-/- RDH8-/--Doppel-Knockout-Mäusen jeweils signifikant höher als bei den Referenztieren. Hinsichtlich des Zustandes der Mikroglia wiesen beide Genotypen im zeitlichen Verlauf Zeichen verstärkter Aktivierung auf, welche sich insgesamt weniger in höheren Zellzahlen, sondern eher in morphologischen Veränderungen der Mikroglia manifestierte. Mikroglia gingen dabei in eine aktivere Form mit größerem Soma und kürzeren Fortsätzen über. Vermehrte Lichtexposition war nur bei RDH8-/--Mäusen mit signifikant steigender Zellzahl und einer signifikanten Veränderung der Mikroglia-Morphologie in die beschriebene Richtung vergesellschaftet. Nach Differenzierung hinsichtlich verschiedener haltungsbedingter Lichtbedingungen wurde offenkundig, dass bei ABCA4-/- RDH8-/--Mäusen Mikroglia mit signifikant aktiverer Morphologie als bei RDH8-/--Mäusen nur unter niedrigerer Lichtexposition vorkommen. Hinsichtlich struktureller Integrität zeigten die ABCA4-/- RDH8-/--Mäuse im direkten Vergleich zwar meistens dezent geringere Zellzahlen und Schichtdicken der plexiformen Schichten als RDH8-/--Mäuse, die Unterschiede waren jedoch bis auf wenige Ausnahmen nicht signifikant. Insgesamt hielt sich die Anzahl an DAPI+ Zellkernen sehr stabil im zeitlichen Verlauf, bei beiden Genotypen waren hier keine starken Degenerationen zu beobachten. Auch nach Differenzierung hinsichtlich der Lichtbedingungen zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Genotypen. Ein Zusammenhang zwischen Lichtexposition und Degenerationsausmaß konnte auf Ebene struktureller retinaler Integrität ebenfalls nicht beobachtet werden. Nach lokaler Differenzierung zwischen superior und inferior des Nervus opticus gelegenen Retinaabschnitten zeigten sich grundsätzlich sehr vergleichbare Kernzahlen und Schichtdicken innerhalb eines Genotyps. In den inferioren Abschnitten waren jedoch gering niedrigere Zellzahlen in der äußeren Körnerschicht und eine etwas dünnere innere plexiforme Schicht für ABCA4-/- RDH8-/--Mäuse als für RDH8-/--Mäuse zu verzeichnen. Die bei Maeda et al. (2008) beschriebenen Veränderungen an der zentralen Retina der Knockoutmäuse konnten in den meisten Gesichtspunkten nicht bestätigt werden. Das Degenerationsausmaß stellte sich in den vorliegenden Auswertungen deutlich geringer dar. Während sich im Alter von 4 Monaten kaum Unterschiede zwischen den ABCA4-/- RDH8-/--Doppel-Knockout-Mäusen und den zum Vergleich untersuchten RDH8-/--Single-Knockout-Mäusen nachweisen ließen, stellte sich ein gewisses, wenn auch eher mildes Degenerationsausmaß im erweiterten Beobachtungszeitraum nach 9 Monaten dar. Einige Unterschiede manifestierten sich erst nach Differenzierung zwischen verschiedenen Lichtbedingungen oder genauerer Eingrenzung des untersuchten Retinaabschnittes. Bei beiden Genotypen kam es zum erwarteten deutlichen Anstieg der Autofluoreszenz im RPE sowie zur morphologischen Veränderung der Mikroglia. Hinsichtlich retinaler Integrität konnten jedoch kaum Unterschiede zum Vergleichsgenotyp gesichert werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das vorbeschriebene Degenerationsausmaß auf eine Inzucht-Crbrd8-Mutation im C57BL/6N-Mausstamm zurückzuführen ist, der in den Arbeiten von Maeda et al. untersucht wurde. Aufgrund des nur geringen Degenerationsausmaßes bei den Mäusen mit C57BL/6J-Hintergrund, welche in meiner Arbeit zum Einsatz kamen, kann dieses Mausmodell nicht für die Untersuchung des oben beschriebenen Genadditionstherapieansatzes eingesetzt werden. Zukünftige Projekte sollten daher den vorgestellten Therapieansatz weiterentwickeln und sein Potential in anderen Modellen weiter evaluieren, die Progression verschiedenster erblich bedingter oder multifaktorieller retinaler Erkrankungen zu verlangsamen, die mit Komplementaktivierung vergesellschaftet sind.

Abstract

The aim of the first part of my doctoral thesis was to investigate the success of an adenoassociated virus (AAV)-based gene addition therapy in a mouse model of retinal ischemia with focus on histomorphological changes in the retina. A shortened and functionally optimized version of the complement modulator complement factor H was intended to be locally overexpressed in the retina via an AAV vector system through intravitreal injection, with the aim of rebalancing the excessive complement response triggered by the lesion. Limiting the exogenous protein production to Müller cells was intended to simplify the application, ensure effective secretion of the target protein miniFH, and protect the sensitive neurons. For this purpose, mouse eyes were examined 3 and 14 days after lesion/ injection. Morphometric analyses of retinal cell nuclei counts and layer thicknesses were combined with cell death analyses via TUNEL assay. Immunohistochemical staining provided insights into the distribution of complement factors within the retina and the extent of Müller cell gliosis. Through immunohistochemical staining of the activation marker CD68, it was possible to assess the activation status of microglia. The staining for the EGFP reporter confirmed a successful transduction of Müller cells, which could be identified by their unique morphology. Regarding the stress/ inflammation markers GFAP and CD68, a pronounced stress situation with strong gliosis and immune response following the lesion was observed. While the microglia activation marker CD68 showed a marked decrease in the immune response after 14 days, revealing a significant benefit for the miniFH treatment, GFAP levels remained high even after 14 days, raising questions about possible contamination, immunological reactions to the viral vector, or Müller cell gliosis independent of complement homeostasis. Immunohistochemical staining for complement factors C3/C3d and CFH allowed me to describe changes in the qualitative and quantitative distribution of these complement factors following the lesion and therapy. The C3 cleavage products, which were stained by my C3d staining, overlapped with signals for the Müller cell marker GFAP and appeared to accumulate in their end feet. Their immunofluorescence signal increased following ischemia and subsided again after 14 days, with indications of lower deposits in the miniFH treated groups. I observed the co-localization of complement factor H and microglia, but at this stage, no definitive statements can be made about the molecular processes of this interaction, nor can it be definitively excluded that it might be endogenous mouse complement factor H. A TUNEL assay was employed to examine the extent of apoptosis or cell death 3 and 14 days after lesion/ injection. After 3 days, highly active inflammatory processes with high apoptosis rates were observed, which only subsided after 14 days and indicated slight advantages of miniFH therapy. Consequently, the advantages of miniFH treatment in terms of retinal integrity were particularly evident after 14 days due to the still active apoptosis processes. Morphometric analyses revealed a significant cell loss following the ischemic period, both in terms of overall DAPIpositive cell nuclei and specifically for ganglion cells and amacrine cells. For all cell types examined, a trend toward the superiority of miniFH treatment was evident at the 14-day time point—partly in improved relative cell survival after 14 days, but particularly in less pronounced cell loss between the two analysis time points compared to the control group. Similar observations were made in the measurement of the thicknesses of the retinal plexiform layers. In summary, while the miniFH therapy did not achieve significant therapeutic success in most analyses, promising and consistent trends were observed. Thus, this work describes the successful establishment of an AAV-mediated overexpression system for a complement modulator at the histological level, which allows for effective and specific transduction of Müller cells and reduces the accumulation of C3 cleavage products. The miniFH gene addition therapy resulted in improved cell survival and reduced microglial activation in the acute and relatively severe degeneration model of retinal ischemia/ reperfusion. The use of this ischemia/ reperfusion model only partially reflects the intended application of the therapy. In the future, further evaluation of the effect in models that simulate a slow progression of disease would be beneficial, ideally with early AAV application before the manifestation of pronounced retinal degeneration. Further optimization approaches could include the enhancement of the AAV vector's effectiveness for Müller cell transduction or the adaptation of the miniFH composition. Specifically, potential manipulations of the myc-tag and its detectability should be optimized. The extent of degeneration could be quantified with ERG support, allowing for finer differentiation of therapeutic effects, as it is known that functional impairments can be detected long before the actual loss of the corresponding cell types. The limited transferability of the results from the mouse model to humans should also be taken into consideration. The data from this part of my dissertation serve as a central core piece for the validation of the in vivo therapeutic effect of miniFH overexpression and are published in the following manuscript: Biber J, Jabri Y, Glänzer S, Dort A, Hoffelner P, Schmidt CQ, Bludau O, Pauly D, Grosche A. Gliosis-dependent expression of complement factor H truncated variants attenuates retinal neurodegeneration following ischemic injury. J Neuroinflammation. 2024;21(1):56. doi: 10.1186/s12974-024-03045-3. PMID: 38388518 In the second part of the thesis, the phenotype of an ABCA4-/- RDH8-/- double knockout mouse model was characterized, which was intended to simulate the retinal manifestation of Stargardt disease. Since no structural degeneration was known for the RDH8-/- single knockout, animals of this genotype were used as a comparison. The characterization was based on the autofluorescence of the retinal pigment epithelium, microglia activation, and structural retinal integrity at 4 and 9 months of age. At 4 months of age, no significant differences between the two genotypes were observed in any of the examined parameters. The measurement of RPE autofluorescence revealed increasing deposits of autofluorescent lipofuscin over time, which is also a typical characteristic of Stargardt disease. The autofluorescence values correlated positively with the intensity of light exposure and were significantly higher in ABCA4-/- RDH8-/- double knockout mice than in the reference animals. In terms of the microglia state, both genotypes showed signs of increased activation over time, manifesting more in morphological changes of the microglia than in higher cell numbers. Microglia transitioned into a more active form with larger somas and shorter processes. Increased light exposure was associated with significantly increasing cell numbers and a significant change in microglia morphology exclusively in RDH8-/- mice. After differentiating based on different housing light conditions, it became apparent that in ABCA4-/- RDH8-/- mice, microglia with significantly more active morphology compared to RDH8-/- mice were found only under lower light exposure. Regarding structural integrity, ABCA4-/- RDH8-/- mice generally showed slightly lower cell counts and plexiform layer thicknesses compared to RDH8-/- mice, but these differences were not significant, with a few exceptions. Overall, the number of DAPI+ nuclei remained stable over time, with no significant degeneration observed in either genotype. No significant differences between the genotypes were found after differentiating based on light exposure. A connection between light exposure and the extent of degeneration could not be observed at the level of structural retinal integrity either. After local differentiation between the superior and inferior sections of the retina relative to the optic nerve, very comparable cell counts and layer thicknesses were observed within each genotype, although in the inferior sections, ABCA4-/- RDH8-/- mice displayed slightly lower cell numbers in the outer nuclear layer and a slightly thinner inner plexiform layer compared to RDH8-/- mice. The changes in the central retina of these knockout mice described by Maeda et al. (2008) could not be confirmed in most aspects; the extent of degeneration was significantly lower in my analyses. At the 4-month time point, merely few differences could be detected between ABCA4-/- RDH8-/- double knockout mice and RDH8-/- single knockout mice; however, a mild degree of degeneration became apparent during the extended observation period of 9 months. Some differences only manifested after differentiating between the light conditions or after more precise localization of the examined retinal section. In both genotypes, the expected significant increase in RPE autofluorescence and the morphological changes in microglia occurred. But few differences could be confirmed regarding retinal integrity compared to the reference genotype. The results suggest that the previously described degree of degeneration is due to an inbred Crbrd8 mutation in the C57BL/6N mouse strain used in the studies by Maeda et al. Due to the only mild degree of degeneration in the mice with a C57BL/6J background used in my work, this mouse model cannot be used for the investigation of the aforementioned gene addition therapy approach. Future projects should continue to develop the presented therapy approach and evaluate its potential in other models to slow the progression of various inherited or multifactorial retinal diseases associated with complement activation.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 25. November 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Grosche, Antje