“On-a-Chip”-Modell eines humanen renalen Progenitorzell-basierten Tubulus zur Untersuchung von Immunzellmigration nach zellulärer Schädigung in vitro

Wilken, Gregor Johannes (2025): “On-a-Chip”-Modell eines humanen renalen Progenitorzell-basierten Tubulus zur Untersuchung von Immunzellmigration nach zellulärer Schädigung in vitro. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

In der Grundlagen- und translationalen Forschung besteht ein Mangel an Modellen mit guter in vitro- zu in vivo-Extrapolation (IVIVE). Dieser wird durch herkömmliche Zellkulturmodelle nicht ausreichend adressiert. Ursächlich hierfür ist einerseits ein aberranter Phänotyp kultivierter Zellen unter statischen, 2D-Zellkulturbedingungen. Hierbei kommt es zum Verlust der in vivo getreuen Polarisation und Funktion der Zellen. Andererseits ist eine normale Gewebestruktur mit 3D-Organisation, Perfusion und physiologischer Interaktion verschiedener Kompartimente (z.B. Organparenchym, Gefäße und extrazellulärer Matrix) mit herkömmlichen in vitro-Methoden nicht realisierbar. Ein weiterer Grund mangelhafter IVIVE ist die weithin verbreitete Anwendung immortalisierter Zelllinien sowie nicht-humaner Zellen. Deren Verwendung leitet sich neben der einfachen Handhabung vor allem daraus ab, dass die Gewinnung primärer humaner Zellen oftmals sehr aufwändig ist. In der nephrologie war dies lange Zeit nur über eine invasive operative Prozedur möglich. Dies hat sich mit der Möglichkeit, humane renale Progenitorzellen (engl.: human renal progenitor cells; hRPCs) aus dem Urin zu extrahieren, wesentlich geändert. In der Forschung sowie in der medizinischen Praxis werden personalisierte diagnostische und therapeutische Ansätze immer wichtiger. Vor diesen Hintergründen sollte im Rahmen dieser Arbeit die Etablierung und Charakterisierung eines mikrofluiden, 3-dimensionalen Modells eines renalen Tubulus erfolgen. Ferner war es das Ziel, Immunzellextravasation und Chemotaxis als Antwort auf eine akute Tubulusschädigung zu modellieren (Modell einer sterilen Inflammation). Hierbei sollten ausschließlich primäre humane Zellen verwendet werden, um neben den Zellkulturbedingungen auch über die Zellen selbst die bestmögliche IVIVE zu erzielen. Zu diesem Zweck wurde die „Organ-on-a-Chip“-Zellkulturplattform OrganoPlate® 3-lane (Mimetas, Leiden) in Kombination mit primären hRPCs und primären humanen Leukozyten genutzt. Die Charakterisierung erfolgte mittels verschiedener in vitro Methoden. Unter bidirektionaler Perfusion (entspr. einer mittleren apikalen Scherkraft von 0,13 dyn/cm2) bildeten 15.000 hRPCs nach drei Tagen einen konfluenten 3D-Tubulus. Dieser zeigte eine stabile Viabilität bei zunehmender Barrierefunktion über den Zeitraum von neun Tagen. Hierbei implizierten die ermittelten Daten eine über diesen Zeitraum hinaus gehende Viabilität des hRPC-Tubulus. An hRPCs konnten keine quantifizierbaren Unterschiede in der Expression von F-Aktin, Na+-K+-ATPase und ZO-1 unter herkömmlichen und 3-dimensionalen, mikrofluiden Zellkulturbedingungen gezeigt werden. Im Ggs. dazu zeigen differenzierte renale Zellen in Abhängigkeit von Scherkraft (engl.: „fluid shear stress“; FSS) und 3D-Formation eine unterschiedliche Expression dieser Marker. Diese Ergebnisse deuten an, dass undifferenzierte hRPCs weniger auf FSS reagieren als differenzierte Tubuluszellen. FSS scheint somit als singulärer Stimulus nicht ausreichend um eine hRPC-Differenzierung zu induzieren. Es erfolgte die Messung der epithelialen Barrierefunktion von hRPC-Tubuli anhand der Diffusion von Fluoreszein markiertem Dextran. Durch chädigung mittels verschiedener Toxine (Cisplatin, Aristolochiasäure, Histone) wurde gezeigt, dass die Barrierefunktion als Parameter in Toxizitätsstudien dienen könnte. Ferner wurde die Expression und Funktionalität des Multidrug-Resistance-Protein 1 (MDR-1) mittels Calcein-Färbung +/- MDR-1-Inhibitor im hRPC-Tubulus gezeigt. Dies illustriert eine potentielle Nutzbarkeit des Modells im Rahmen von Interaktionsstudien (engl.: „Drug-Drug-Interaction“, DDI). Abschließend konnte nach Histon-induzierter Schädigung des hRPC-Tubulus die Migration primärer humaner Leukozyten induziert werden. Diese migrierten hierbei, dem chemotaktischen Gradienten der Zellschädigung folgend, aus einem perfundierten Kanal in die Kollagen-I Matrix in Richtung des hRPC-Tubulus. Hierbei zeigte sich eine Zunahme der Anzahl migrierender Lymphozyten in Abhängigkeit vom Ausmaß des Tubulusschadens. Die Ergebnisse dieser Modelletablierungsarbeit zeigen, dass die Organ-on-a-Chip Technologie in Kombination mit primären humanen Zellen ein vielversprechender Ansatz zur Verbesserung der IVIVE ist. Gerade in dem Bereich präklinischer Toxizitäts- und DDI Studien sowie im rasant wachsenden Feld der personalisierten Medizin ergeben sich hierdurch neue Möglichkeiten. Aufgrund des verbesserten räumlichen und physiko-mechanischen Mikromilieus ermöglicht die Organ-on-a-Chip-Technologie hochkomplexe Ko-Kulturen sowie Langzeitkulturen. Dies kann einen wertvollen Beitrag in der Grundlagen- und translationalen Forschung leisten. Des Weiteren kann so ein signifikanter Beitrag zur Reduktion von Tierversuchen geleistet werden. Die Sinnhaftigkeit solcher Ansätze hat mit dem 3R-Prinzip („Replace-Reduce-Refine“) der EU-Richtlinie „zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere“ auch einen rechtlichen Rahmen gefunden.

Abstract

In basic and translational research, there is a lack of models with good in vitro to in vivo extrapolation (IVIVE). This need is not sufficiently addressed by conventional cell culture models. One reason for this is an aberrant phenotype of cultured cells with loss of in vivo polarization and function under static 2D conditions. On the other hand, a normal tissue structure with 3D organization, perfusion, and physiological interaction of different compartments (e.g. organ parenchyma, vessels and extracellular matrix) cannot be generated with conventional in vitro methods. Another reason for inadequate IVIVE is the widespread use of immortalized cell lines and non-human cells. Their vast use is mainly due to their simple handling and the reduced availability and complex isolation of primary human cells. In the field of Nephrology the isolation of primary cells was for a long time only possible through invasive interventions. This has changed significantly with the possibility of extracting human renal progenitor cells (hRPCs) from urine. Personalized diagnostic and therapeutic approaches are becoming increasingly important in research and medical practice. Thus, the aim of this work was to establish and characterize a microfluidic, 3-dimensional model of a renal tubule. A further aim was to establish a model of acute tubular damage with consecutive immune cell extravasation and chemotaxis through an extracellular matrix. Only primary human cells were to be used to achieve the best possible IVIVE. For this purpose, the “organ-on-a-chip” cell culture platform OrganoPlate® 3-lane (Mimetas, Leiden) was used in combination with primary hRPCs and primary human leukocytes. Characterization was performed using various in vitro methods. Under bidirectional perfusion with a resulting mean apical shear stress of 0.13 dyn/cm2, 15,000 hRPCs formed a confluent 3D tubule after three days. This showed stable viability with increasing barrier function over the period of nine days, whereby the data obtained implied a viability of the hRPC tubule extending beyond this period. Interestingly, hRPCs showed no significant differences in the expression of F-actin, Na+-K+-ATPase and ZO-1 under 3-dimensional microfluidic cell culture conditions compared to conventional 2D cell culture conditions. While differentiated renal cells show a marked change in these markers in response to shear stress and 3D formation, this implied that hRPCs may require additional biological factors for differentiation. Dextran-based measurements of the epithelial barrier function of hRPC tubules after damage by various toxins (cisplatin, aristolochic acid, histones) indicated that barrier function could serve as a parameter in toxicity studies. Furthermore, the expression and functionality of Multidrug-Resistance Protein 1 (MDR-1) was shown by calcein staining +/- MDR-1 inhibitor in the hRPC tubule. This illustrated the usefulness of the model in the context of drug-drug interaction (DDI) studies. Finally, after histone-induced damage to the hRPC tubule, the migration of primary human leukocytes from a perfused compartment into the collagen I matrix towards the site of damage was demonstrated (in the sense of initiation of sterile inflammation). An increase in the number of migrating lymphocytes depending on the extent of tubular damage. The results of this model establishment work show that organ-on-a-chip technology in combination with primary human cells could be a promising approach for improving IVIVE. Especially in the field of preclinical studies on toxicity and DDI as well as in the rapidly growing field of personalized medicine, this paves the way for new ossibilities. With the help of improved spatial and physico-mechanical microenvironments, the organ-on-a-chip technology enables highly complex co-cultures as long-term cultures. This can make a valuable contribution to basic and translational research. Furthermore, a significant contribution to the reduction of animal experiments could be made, which has also found a legal framework with the 3R principle (“Replace-Reduce-Refine”) of the EU Directive “on the protection of animals used for scientific purposes” implemented in 2010.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Organ-on-a-chip, Kidney-on-a-chip, cell culture, in vitro, cell-migration, chemotaxis, inflammation, kidney injury
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 27. Oktober 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Anders, Hans-Joachim