Pharmacodynamics of carfentanil and its neutralization by antagonists and antibodies in HEK293-µOR cells

Endt, Franziska Clara (2025): Pharmacodynamics of carfentanil and its neutralization by antagonists and antibodies in HEK293-µOR cells. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Highly potent synthetic opioids, such as carfentanil (CAR), pose significant challenges to the healthcare system due to their misuse as drugs and potential application as chemical weapons. The interactions between CAR and the µ-opioid receptor (µOR) remain poorly understood and current treatments with µOR antagonists, such as naloxone, are often insufficient. This study aims to elucidate the pharmacodynamics of CAR at µOR, assess its impact on antagonist effectiveness and evaluate anti-fentanyl antibodies for their potential to neutralize CAR´s µOR binding and activation. Binding assays using HEK293 cells stably expressing the µOR and [³H]-naloxone as a tracer were performed to determine the binding affinities of CAR, fentanyl (FEN), remifentanil (REMI), morphine (MOR) and endomorphin-1 (ENDO). In combination with functional characterization through forskolin-stimulated cyclic adenosine monophosphate (cAMP) assays and Western Blot analysis of extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) phosphorylation, this analyses demonstrated that CAR acts as a high-affinity ligand with exceptionally strong cAMP inhibition, yet induces comparatively weak ERK1/2 phosphorylation. µOR phosphorylation patterns, analyzed by ELISA at saturated opioid concentrations, showed that CAR promotes significantly increased phosphorylation at residues T370 and T379, distinguishing it from other tested opioids. A phospho-kinase array was used to screen for opioid-induced phosphorylation profile of cellular proteins; however, CAR exhibited phosphorylation patterns largely comparable to those of the other opioids tested. Antagonist potency against opioid concentrations of equal affinity was assessed in cAMP assays, revealing that both naloxone and nalmefene were significantly less effective at reversing CAR-induced µOR activation. The potential of anti-fentanyl antibodies to interfere with opioid binding and signaling was evaluated through additional binding and cAMP assays. Of nine antibodies tested, three selectively blocked FEN binding, four inhibited both FEN and CAR and one uniquely targeted CAR, with no cross-reactivity toward REMI, MOR or ENDO. Selected antibodies also attenuated CAR- and FEN-induced cAMP signaling, although inhibition was generally more potent for FEN. The pharmadynamic analysis revealed a unique µOR conformation stabilized by CAR that elicits selectively ultra-active cAMP inhibition and increased µOR phosphorylation, while showing reduced sensitivity to antagonists. Neutralizing CAR with specific antibodies could inhibit µOR binding independently of its conformation. This study underscores the need for alternative countermeasures, highlighting the potential of antibodies in treating or preventing FEN and CAR intoxications.

Abstract

Abgesehen von ihren medizinischen Vorteilen stellen hochpotente synthetische Opioide wie Carfentanil (CAR) das Gesundheitssystem vor Herausforderungen, da sie missbräuchlich als Drogen oder potenzielle chemische Waffen verwendet werden können. Die Interaktionen zwischen CAR und µ-Opioidrezeptoren (µOR) sind nicht ausreichend verstanden und die aktuelle Standardtherapie mit µOR-Antagonisten (z. B. Naloxon) ist oft unzureichend. Alternative Gegenmaßnahmen sind dringend erforderlich. Diese Studie zielt darauf ab, die Pharmakodynamik von CAR am µOR zu untersuchen, um Mechanismen zu identifizieren, die CAR´s hoher Toxizität zugrunde liegen könnten. Darüber hinaus untersucht sie die Effektivität der Antagonisten Naloxon und Nalmefen gegen CAR und analysiert spezifische Anti-Fentanyl-Antikörper hinsichtlich ihrer neutralisierenden Wirkung auf die µOR-Bindung und -Aktivierung sowie hinsichtlich der Kreuzreaktivität zu anderen Opioiden in vitro. Liganden-Bindungsassays mit stabil µOR-exprimierenden HEK293-Zellen und [³H]-Naloxon als Tracer dienten der Bestimmung der Bindungsaffinitäten von CAR, Fentanyl (FEN), Remifentanil (REMI), Morphin (MOR) und Endomorphin-1 (ENDO). Ergänzend dazu zeigten forskolin-stimulierte Assays zur Messung von zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) sowie Western-Blot-Analysen der Phosphorylierung der extrazellulären signalregulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2), dass CAR ein hochaffiner Ligand mit außergewöhnlich starker Aktivierung des cAMP-Signalwegs ist, jedoch nur eine vergleichsweise geringe ERK1/2-Phosphorylierung induziert. Die Untersuchung der µOR-Phosphorylierung mittels ELISA bei gesättigten Opioidkonzentrationen ergab, dass CAR eine deutlich stärkere Phosphorylierung an den Aminosäuren T370 und T379 bewirkt als andere getestete Opioide. Ein Phospho-kinase Array zur Analyse opioid-induzierter Phosphorylierungsmuster zellulärer Proteine zeigte, dass CAR weitgehend ähnliche Muster wie die anderen Opioide hervorrief. Die Wirksamkeit der Antagonisten Naloxon und Nalmefen gegen die Opioide wurde anhand von cAMP-Assays unter Berücksichtigung gleicher Rezeptorbelegung überprüft; dabei zeigte sich, dass beide Antagonisten deutlich weniger effektiv waren, die CAR-induzierte µOR-Aktivierung zu blockieren. Das Potenzial von Anti-Fentanyl-Antikörpern, die Bindung und Signaltransduktion von Opioiden zu hemmen, wurde in weiteren Bindungs- und cAMP-Assays untersucht. Von neun getesteten Antikörpern blockierten drei selektiv die FEN-Bindung, vier hemmten sowohl FEN als auch CAR und ein Antikörper erkannte spezifisch CAR, ohne Kreuzreaktionen mit REMI, MOR oder ENDO zu zeigen. Zudem konnten ausgewählte Antikörper die cAMP-Inhibition durch CAR und FEN abschwächen - wobei die Potenz gegen FEN insgesamt stärker ausfiel. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass CAR eine einzigartige µOR-Konformation stabilisiert, die durch eine außergewöhnlich hohe Effektivität im cAMP-Signalweg, verstärkte Rezeptor-Phosphorylierung und eine verminderte Empfindlichkeit gegenüber Antagonisten gekennzeichnet ist. Die Neutralisierung von CAR durch spezifische Antikörper könnte die µOR-Bindung unabhängig von seiner Konformation unterbinden. Damit verdeutlicht diese Arbeit die dringende Notwendigkeit alternativer therapeutischer Ansätze und unterstreicht das Potenzial spezifischer Antikörper bei der Behandlung oder Prävention von FEN- und CAR-Vergiftungen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Carfentanil, Opioids, Pharmacodynamics, Antibodies
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 6. November 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Gudermann, Thomas