Targeting pro-inflammatory signaling in atherosclerotic stroke

Živković, Luka (2025): Targeting pro-inflammatory signaling in atherosclerotic stroke. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Stroke is one of the leading causes of death and disability worldwide. Ischemic stroke, the most common subtype, occurs when a brain-supplying artery is suddenly occluded, limiting the supply of oxygen and nutrients to the affected central nervous tissue. Around 20% of all ischemic strokes are attributed to large artery atherosclerosis and require the management of cardiovascular risk factors for both primary and secondary prevention. Atherosclerosis is initiated by hemodynamic damage to the endothelial lining, which results in the accumulation of lipids in the arterial intima layer and elicits an innate immune response that gradually derails due to the insufficient clearing of the accumulating lipids and the resulting inflammation. Over time, atherosclerotic plaques begin to convey a risk of erosion and rupture, which, in turn, cause thrombosis and occlusion of distal arteries. Proneness to rupture is, among other factors, determined by the activity of pro-inflammatory signaling pathways through modulating plaque composition; high intraplaque inflammation is commonly associated with vulnerable plaque phenotypes. The C-C chemokine ligand 2/C-C chemokine receptor 2 (CCL2/CCR2) axis is a mainstay of atherogenic inflammation that facilitates the invasion of circulating monocytes into atherosclerotic plaques. Epidemiologic and genetic studies have pinpointed CCL2 concentrations and activity as conveying risk of atherosclerotic disease, while animal models of CCL2/CCR2 inactivation revealed decreased plaque burden, suggesting the CCL2/CCR2 axis as a potential anti-inflammatory drug target. The Nuclear factor-kappa B (NF-κB) pathway, a key regulator of innate immunity, drives CCL2 expression along with a large amount of other pro-inflammatory genes. Its signaling relies on the activity of the IKK kinases. NF-κB is also responsible for the expression of NLRP3, a pattern recognition receptor that, once activated, causes the production and release of Interleukin-1 beta (IL-1β). IL-1β is a potent cytokine that upregulates the local and systemic immune response through further activation of NF-κB and is thus essential for atherogenic inflammation. IL-1β also licenses the expression of IL-6, a cytokine with wide-reaching systemic effects that governs the acute phase reaction in inflammation. Like CCL2 and IL-1β, IL-6 has been causally implicated in atherosclerotic disease by converging preclinical, epidemiological and genetic evidence. The utility of IL-6 and the acute phase C-reactive protein (CRP) as circulating biomarkers for risk stratification in atherosclerotic diseases has been demonstrated in large cohort studies. Drugs targeting pro-inflammatory mechanisms in coronary artery disease and stroke have entered clinical trials and, in the case of Colchicine, received regulatory approval for the prevention of cardiovascular events in high-risk patients. We identify three obstacles remaining in the way of further clinical translation, namely (1) the lack of systematic overviews of studies testing anti-inflammatory agents in animal models for scrutinizing and prioritizing drug targets, (2) the need for exploration of interactions between different molecular actors of inflammation in atherosclerosis for the discovery of druggable mechanisms, and (3) the need for characterizing the downstream effects of interleukin signaling inhibition for the identification of suitable athero-specific targets. In Publication I, we systematically searched the available literature for studies investigating direct pharmacological inhibition of CCL2 or CCR2 in animal models of atherosclerosis. Pooling 14 mouse studies of 11 different agents in random-effects meta-analyses, we observed a significant reduction in plaque burden across multiple vascular frames and an increase in composition features conveying plaque stability. We also noted that the reduction of plaque size correlated with reduction of plaque macrophage content, confirming the role of CCL2/CCR2 for macrophage accumulation, and no differences in efficacy were observed when comparing ligand and receptor inhibition. In Publication II, we investigated the role of the NF-κB kinase IKKβ on NLRP3 inflammasome priming and activation. We detected direct mechanistic binding of IKKβ to NLRP3 in both overexpressed and endogenous cell cultures that was further confirmed using in-vitro binding assays, colocalization imaging and proteomic profiling. In murine macrophages, inhibition of IKKβ using a small-molecule agent and short interfering RNA (siRNA) suppressed NLRP3 activation and abrogated IL-1β maturation. To uncouple the putative effect of IKKβ for NLRP3 activation from its NF-κB-mediated effects on NLRP3 priming, we inhibited IKKβ in rapid priming and post-priming inhibition experiments, maintaining the observed effect. In Publication III, we examined the proteomic signature of genetically proxied IL-6 receptor (IL-6R) signaling inhibition, revealing 70 differentially expressed circulating proteins. After examining the association of genetic instruments proxying circulating levels of these proteins with cardiovascular outcomes, we found C-X-C motif chemokine ligand 10 (CXCL10) to be associated with risk of coronary artery disease (CAD), large-artery atherosclerotic stroke and peripheral artery disease. We then looked at associations between circulating levels of CXCL10 and major adverse cardiovascular events (MACE) in a population-based cohort, noting that individuals with higher CXCL10 levels exhibited higher risk of MACE. Lastly, we observed increased lipid core size and a pro-inflammatory transcriptomic profile in carotid artery plaques with increased CXCL10 expression, suggesting a causal role in atherosclerosis. Taken together, our findings further solidify the role of pro-inflammatory mechanisms in atherosclerotic stroke while aiming to inform the design of future clinical trials.

Abstract

Der Schlaganfall ist eine der weltweit führenden Ursachen für Tod und Behinderung. Sein häufigster Subtyp, der ischämische Schlaganfall, ist definiert durch einen plötzlichen Verschluss hirnversorgender Arterien und die darauffolgende Unterbrechung der Sauerstoff- und Nährstoffzufuhr des betroffenen Nervengewebes. Etwa 20% aller ischämischen Schlaganfälle sind makroangiopathischer, genauer atherosklerotischer Genese und erfordern daher die Reduktion kardiovaskulärer Risikofaktoren als primär- und sekundärpräventive Maßnahmen. Atherosklerose wird als Antwort auf hämodynamische Beanspruchung des arteriellen Endothels gesehen, welche zur Einlagerung von Lipiden in die Gefäßwand und einer zunehmend entgleisenden Entzündungsreaktion führt. Atherosklerotische Plaques ziehen mit der Zeit das Risiko der Ruptur und Erosion nach sich, welche Thrombosen und schlussendlich Ischämien verursachen. Maßgeblich beeinflusst wird die Plaquestabilität durch die Aktivität pro-inflammatorischer Signalwege und ihren Einfluss auf Morphologie und Zusammensetzung; dabei ist ein hohes Entzündungsniveau innerhalb der Plaque klassischerweise mit Vulnerabilitätsmerkmalen assoziiert. Die CC-Chemokin-Ligand-2/CC-Chemokin-Rezeptor-2 (CCL2/CCR2)-Achse spielt eine tragende Rolle in der Invasion von Monozyten, den Vorläuferzellen von Makrophagen, aus der Blutbahn in die Gefäßwand. Epidemiologische und genetische Studien haben CCL2-Spiegel und -Aktivität als kausalen Risikofaktor für atherosklerotische Krankheitsbilder nahegelegt, während Tierstudien Reduktionen in Größe und Anzahl von Plaques nach Ausschaltung der CCL2/CCR2-Achse erbringen konnten. Diese Belege sprechen für eine Rolle der CCL2/CCR2-Achse als therapeutischen Angriffspunkt in Atherosklerose. Der NF-kappaB (NF-κB)-Signalweg, ein Schlüsselspieler des angeborenen Immunsystems, reguliert die Genexpression von CCL2 gemeinsam mit zahlreichen anderen pro-inflammatorischen Genen. Innerhalb des NF-κB-Signalwegs sind insbesondere die IKK-Kinasen maßgeblich für die Aufrechterhaltung der Signalkaskade. NF-κB ist außerdem verantwortlich für die Expression von NLRP3, einem Pattern-Recognition-Rezeptor, welcher in seinem aktivierten Zustand Interleukin 1β (IL-1β) produziert und freisetzt. IL-1β ist ein potentes Zytokin, welches NF-κB weiter aktiviert und damit sowohl die lokale als auch die systemische Entzündungsantwort hochreguliert; IL-1β ist daher essenziell für Entzündung in Atherosklerose. IL-1β reguliert hierdurch auch die Expression von IL-6, einem Zytokin, welchem durch die Kontrolle der Akute-Phase-Reaktion eine weitreichende Bedeutung in der systemischen Immunantwort eingeräumt wird. Wie CCL2 und IL-1β konnte auch IL-6 durch vorklinische, epidemiologische und genetische Studien kausal in der Pathophysiologie der Atherosklerose verankert werden. Der Nutzen von IL-6- und CRP-Spiegeln in der Risikostratifizierung für atherosklerotische Erkrankungen wurde in großen Kohortenstudien vielfach dargelegt. Die Entwicklung und Testung anti-inflammatorischer Pharmaka gegen die Koronare Herzkrankheit (KHK) und den Schlaganfall hat klinische Studienphasen und im Fall Colchicin sogar die Zulassung in der Sekundärprävention des akuten Myokardinfarkts erreicht. Nichtsdestotrotz verbleibt die klinische Translation an einigen Punkten auf der Stelle. Zu den Ursachen hierfür zählen wir einen Mangel an systematischen Übersichtsarbeiten präklinischer Studien mit anti-inflammatorischen Therapieansätzen als Thema, fehlende Erkenntnisse über Interaktionen zwischen den verschiedenen molekularen Akteuren in Atherosklerose sowie die weitgehend ausgebliebene Erforschung nachgeschalteter Effekte unter Interleukin-Inhibition. In Publikation I durchsuchten wir etablierte Literaturdatenbanken nach Studien, welche über experimentelle Daten zur Inhibition der CCL2/CCR2-Achse in Atherosklerose-Tiermodellen verfügen. Nach der Auswertung von 14 Mausstudien von 11 Inhibitoren in Zufallseffekt-Metaanalysen stellten wir eine signifikante Abnahme der Plaquebelastung und eine signifikante Zunahme histologischer Stabilitätsmerkmale unter CCL2/CCR2-Inhibition fest. Wir beobachteten außerdem eine Korrelation der Reduktion von Plaquegröße und Makrophagengehalt, einhergehend mit der Rolle der CCL2/CCR2-Achse in der Akkumulation von Monozyten. Ob CCL2 oder CCR2 pharmakologisch inhibiert wurden, ergab unseren Ergebnissen zufolge keinen Unterschied mit Blick auf atherosklerosehemmende Effekte. In Publikation II untersuchten wir die Rolle der NF-κB-Kinase IKKβ in der Bahnung und Aktivierung von NLRP3. Wir beobachteten eine direkte, mechanistische Interaktion zwischen IKKβ und NLRP3 sowohl in Überexpressions- als auch in endogenen Zellkulturmodellen, welche durch in-vitro-Bindungsassays, Kolokalisierungsversuche und proteomische Untersuchungen weiter bestätigt werden konnte. Die pharmakologische Ausschaltung von IKKβ in murinen Makrophagen führte zur Aussetzung der NLRP3-Aktivierung und Aufhebung der IL-1β-Produktion. Diese Effekte waren auch zu beobachten, als wir durch Modifizierung des Inhibitionsansatzes den direkten, mechanistischen Effekt von IKKβ auf NLRP3 von dem durchaus zu erwartenden, NF-κB-vermittelten Bahnungseffekt entkoppelten. In Publikation III analysierten wir unter Zuhilfenahme eines Mendelschen Randomisierungsansatzes proteomische Merkmale reduzierter IL-6-Rezeptor (IL6-R)-Aktivität. Hierbei beobachteten wir unterschiedliche Expressionsprofile für 70 zirkulierende Proteine. Daraufhin konstruierten wir genetische Instrumente stellvertretend für die Blutspiegel dieser Proteine und untersuchten ihre Assoziation mit kardiovaskulären Erkrankungen. Dabei beobachteten wir für den CX-Chemokin-Liganden 10 (CXCL10) eine Assoziation mit erhöhtem Risiko für KHK und makroangiopathischem Schlaganfall. Als nächstes betrachteten wir CXCL10-Spiegel in einer bevölkerungsbezogenen Studie, wobei diese abermals mit kardiovaskulären Ereignissen assoziierten. Schließlich legten wir in einer Auswertung von Plaqueproben aus humanen Carotiden dar, dass Plaques mit höherer Expression von CXCL10 einem höheren Risiko für große Lipidkerne und einem pro-inflammatorischen transkriptomischen Profil ausgesetzt sind, was auf eine kausale Rolle in Atherosklerose deutet. Abschließend betrachtet festigen unsere Ergebnisse die Bedeutung proinflammatorischer Mechanismen für die Entstehung des atherosklerotischen Schlaganfalls und liefern Erkenntnisse für die Planung künftiger klinischer Studien.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: stroke, atherosclerosis, inflammation, chemokine, anti-inflammatory, meta-analysis, proteomics, mendelian randomization, Schlaganfall, Atherosklerose, Entzündung, Chemokin, antiinflammatorisch, Metaanalyse, Proteomik, Mendelsche Randomisierung, CCL2, CCR2, NF-kappa B, NF-ᴋB, IKKβ, IKK2, NLRP3, IL-1, IL-6, CXCL10
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 16. Oktober 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Dichgans, Martin