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Endotheliale Superoxidanionen–Bildung. Rolle der NAD(P)H – Oxidase und ihre Modulation durch das Membranpotential
Endotheliale Superoxidanionen–Bildung. Rolle der NAD(P)H – Oxidase und ihre Modulation durch das Membranpotential
Reaktive – Sauerstoff - Spezies (ROS) spielen in der Physiologie und Pathophysiologie des vaskulären Systems eine wichtige Rolle. So kommt es z.B. bei Hypertonie, Atherosklerose, Ischämie / Reperfusion und weiteren Krankheiten und Stoffwechselstörungen, wie z.B. Hypercholesterinämie und Diabetes mellitus zu einem Ungleichgewicht zwischen Sauerstoffradikalbildung und anti - oxidativen Mechanismen. Superoxidanionen (O2 -) spielen insofern eine besondere Rolle, als sie durch direkte Interaktion endotheliales NO inaktivieren, so daß es seine vasodilatatorische, anti – proliferative und plättchenaggregationshemmende Funktion nicht mehr voll erfüllen kann. Damit ist O2 - maßgeblich an der Induktion der Endotheldysfunktion beteiligt. Bei Beginn dieser Arbeit gab es erste Hinweise, daß eine der leukozytären NAD(P)H - Oxidase ähnlichen Oxidase auch im Endothel existiert und wesentlich zur endothelialen O2 - - Bildung beiträgt. Wenig erforscht waren jedoch die Regulationsmechanismen dieser Oxidase. Ein bisher noch nicht bekannter Stimulus zur Steigerung der endothelialen O2 - - Bildung wurde 1996 beschrieben. In Endothelzellen aus bovinen Pulmonararterien führte eine Depolarisation zu einer gesteigerten O2 - - Bildung. Dies kann insofern von Bedeutung sein, als es sowohl unter physiologischen, als auch pathophysiologischen Bedingungen zu akuten oder chronischen Veränderungen des endothelialen Membranpotentials kommt. In dieser Arbeit wurde nun untersucht, ob eine NAD(P)H – Oxidase in der Tat auch in humanen Endothelzellen vorhanden ist, ob sie im Gegensatz zur leukozytären Form konstitutiv aktiv ist, und welchen Beitrag sie zur basalen endothelialen O2 - - Bildung leistet. Weitere Untersuchungen in HUVEC sollten zeigen, ob und wie sich sowohl De – als auch Hyperpolarisation der Zellmembran auf die O2 - - Bildung auswirken, welches Enzym hierbei eine Rolle spielt und welche Signaltransduktionsmechanismen beteiligt sind. Zur O2 - - Messung an vaskulären Zellen war die Verwendung der Lucigenin – Chemilumineszenz – Methode etabliert, so daß auch hier anfänglich mit dieser Methode gearbeitet wurde. Da jedoch dann Befunde veröffentlicht wurden, die zeigten, daß Lucigenin in Enzymsyste-men, die sonst kein oder nur wenig O2 - produzieren, zu einer erheblichen O2 - - Bildung führte, mußte mit weiteren Methoden der O2 - - Messung überprüft werden, ob diese Nachteile auch unter unseren Versuchsbedingungen auftraten. Verwendet wurden hierzu die MCLA – verstärkte Chemilumineszenz, die NBT – und Cytochrom C – Methode. Mit diesen verschiedenen, voneinander unabhängigen Methoden zeigte sich, daß in Anwesenheit von NADH Lucigenin selbst zu einer wesentlich gesteigerten O2 - - Bildung in Lysaten von humanen Umbilikalvenenendothelzellen (HUVEC) führt. Daher wurde zur Untersuchung der endothelialen O2 - - Bildung in dieser Arbeit schließlich nur die Cytochrom C Methode verwendet. Zur Überprüfung der Auswirkungen der verwendeten Substanzen auf das Membranpotential wurde die Membranpotentialmeßmethode mittels dem Potential – sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Bis - oxonol aufgebaut und verwendet. Intakte HUVEC zeigten eine basale O2 - - Produktion, die durch bekannte Inhibitoren der leukozytären NAD(P)H – Oxidase, mit unterschiedlichen Wirkmechanismen signifikant gehemmt wurde (Diphenyleniodonium ca. 48%, Phenylarsenoxid ca. 34% ). Ebenso resultierte die Inaktivierung des GTP - bindenden - Proteins rac mit Clostridium difficile Toxin B in einer signifikanten Reduktion der basalen endothelialen O2 - - Produktion um ca. 30%. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß nach Aufhebung der zellulären Integrität durch das Lysieren der HUVEC die Gabe von NADH eine um ca. 2.7 fach erhöhte O2 - - Produktion im Vergleich zu NADPH bewirkte. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz bzw. rtPCR konnten außerdem zumindest ein Teil der leukozytären NAD(P)H – Oxidase Untereinheiten, p67phox und gp91phox auch in HUVEC nachgewiesen werden. Zur gezielten Depolarisation des Membranpotentials wurden ein Puffer mit erhöhter Kaliumkonzentration (90 mM), der nicht selektive Kalium – Kanal - Blocker Tetrabutylammonium Chlorid (1 mM) und das Kation – Ionophor Gramicidin (1 µM) verwendet. Die basale endotheliale O2 - - Produktion wurde durch diese Substanzen in ähnlichem Ausmaß (~ 60% ) signifikant gesteigert (n=23, p<0.01). Dagegen senkte die Hyperpolarisation durch Öffnung von KATP Kanälen mittels Hoe 234 (1 mM) signifikant die O2 - - Bildung. Nach Auflösung der zellulären Integrität zeigten zuvor depolarisierte Zellen (1h bzw. 6h ) eine gesteigerte NADH - abhängige O2 - - Bildung, die jedoch nicht mit einem erhöhten mRNA Gehalt von Untereineinheiten der NAD(P)H - Oxidase assoziiert war. Die Depolarisation induzierte sowohl eine gesteigerte Tyrosinphosphorylierung von verschiedenen, bisher noch nicht näher charakterisierten Proteinen (90 - 110 kD), als auch eine signifikante Steigerung der Membranassoziation des G - Proteins rac. Die Inaktivierung von rac unterdrückte dabei den steigernden Effekt der Depolarisation auf die endotheliale O2 - - Bildung. Weiterhin bewirkte die Hemmung von Tyrosinkinasen mit Genistein (30 µM, n=15) sowohl eine Aufhebung der durch Depolarisation gesteigerten O2 - - Bildung als auch der damit assoziierten rac – Translokation. Zusammenfassend kann aus diesen Daten geschlossen werden, daß eine der leukozytären Form ähnliche NADP(H) - Oxidase in humanen Endothelzellen vorhanden ist, bei deren Regulation das kleine G -Protein rac ein wichtige Rolle spielt. Im Gegensatz zu Leukozyten zeigte sich im Endothe l jedoch eine konstitutive, bevorzugt NADH – abhängige, O2 - - Bildung. Membranpotentialänderungen beeinflußten die Aktivität dieser NAD(P)H - Oxidase, wobei durch Depolarisation die endotheliale O2 -- Bildung erhöht und durch Hyperpolarisation mittels Öffnung von K+ ATP Kanälen gesenkt wird. Tyrosinphosphorylierungs - abhängige Signalschritte, sowie die Aktivierung und Translokation der GTPase rac stellen einen entscheidenden Schritt in der Signaltransdukion der durch Depolarisation - gesteigerten O2 - - Bild ung dar.
Not available
Keller, Matthias
2002
Deutsch
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Keller, Matthias (2002): Endotheliale Superoxidanionen–Bildung: Rolle der NAD(P)H – Oxidase und ihre Modulation durch das Membranpotential. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät
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Abstract

Reaktive – Sauerstoff - Spezies (ROS) spielen in der Physiologie und Pathophysiologie des vaskulären Systems eine wichtige Rolle. So kommt es z.B. bei Hypertonie, Atherosklerose, Ischämie / Reperfusion und weiteren Krankheiten und Stoffwechselstörungen, wie z.B. Hypercholesterinämie und Diabetes mellitus zu einem Ungleichgewicht zwischen Sauerstoffradikalbildung und anti - oxidativen Mechanismen. Superoxidanionen (O2 -) spielen insofern eine besondere Rolle, als sie durch direkte Interaktion endotheliales NO inaktivieren, so daß es seine vasodilatatorische, anti – proliferative und plättchenaggregationshemmende Funktion nicht mehr voll erfüllen kann. Damit ist O2 - maßgeblich an der Induktion der Endotheldysfunktion beteiligt. Bei Beginn dieser Arbeit gab es erste Hinweise, daß eine der leukozytären NAD(P)H - Oxidase ähnlichen Oxidase auch im Endothel existiert und wesentlich zur endothelialen O2 - - Bildung beiträgt. Wenig erforscht waren jedoch die Regulationsmechanismen dieser Oxidase. Ein bisher noch nicht bekannter Stimulus zur Steigerung der endothelialen O2 - - Bildung wurde 1996 beschrieben. In Endothelzellen aus bovinen Pulmonararterien führte eine Depolarisation zu einer gesteigerten O2 - - Bildung. Dies kann insofern von Bedeutung sein, als es sowohl unter physiologischen, als auch pathophysiologischen Bedingungen zu akuten oder chronischen Veränderungen des endothelialen Membranpotentials kommt. In dieser Arbeit wurde nun untersucht, ob eine NAD(P)H – Oxidase in der Tat auch in humanen Endothelzellen vorhanden ist, ob sie im Gegensatz zur leukozytären Form konstitutiv aktiv ist, und welchen Beitrag sie zur basalen endothelialen O2 - - Bildung leistet. Weitere Untersuchungen in HUVEC sollten zeigen, ob und wie sich sowohl De – als auch Hyperpolarisation der Zellmembran auf die O2 - - Bildung auswirken, welches Enzym hierbei eine Rolle spielt und welche Signaltransduktionsmechanismen beteiligt sind. Zur O2 - - Messung an vaskulären Zellen war die Verwendung der Lucigenin – Chemilumineszenz – Methode etabliert, so daß auch hier anfänglich mit dieser Methode gearbeitet wurde. Da jedoch dann Befunde veröffentlicht wurden, die zeigten, daß Lucigenin in Enzymsyste-men, die sonst kein oder nur wenig O2 - produzieren, zu einer erheblichen O2 - - Bildung führte, mußte mit weiteren Methoden der O2 - - Messung überprüft werden, ob diese Nachteile auch unter unseren Versuchsbedingungen auftraten. Verwendet wurden hierzu die MCLA – verstärkte Chemilumineszenz, die NBT – und Cytochrom C – Methode. Mit diesen verschiedenen, voneinander unabhängigen Methoden zeigte sich, daß in Anwesenheit von NADH Lucigenin selbst zu einer wesentlich gesteigerten O2 - - Bildung in Lysaten von humanen Umbilikalvenenendothelzellen (HUVEC) führt. Daher wurde zur Untersuchung der endothelialen O2 - - Bildung in dieser Arbeit schließlich nur die Cytochrom C Methode verwendet. Zur Überprüfung der Auswirkungen der verwendeten Substanzen auf das Membranpotential wurde die Membranpotentialmeßmethode mittels dem Potential – sensitiven Fluoreszenzfarbstoff Bis - oxonol aufgebaut und verwendet. Intakte HUVEC zeigten eine basale O2 - - Produktion, die durch bekannte Inhibitoren der leukozytären NAD(P)H – Oxidase, mit unterschiedlichen Wirkmechanismen signifikant gehemmt wurde (Diphenyleniodonium ca. 48%, Phenylarsenoxid ca. 34% ). Ebenso resultierte die Inaktivierung des GTP - bindenden - Proteins rac mit Clostridium difficile Toxin B in einer signifikanten Reduktion der basalen endothelialen O2 - - Produktion um ca. 30%. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß nach Aufhebung der zellulären Integrität durch das Lysieren der HUVEC die Gabe von NADH eine um ca. 2.7 fach erhöhte O2 - - Produktion im Vergleich zu NADPH bewirkte. Mit Hilfe der Immunfluoreszenz bzw. rtPCR konnten außerdem zumindest ein Teil der leukozytären NAD(P)H – Oxidase Untereinheiten, p67phox und gp91phox auch in HUVEC nachgewiesen werden. Zur gezielten Depolarisation des Membranpotentials wurden ein Puffer mit erhöhter Kaliumkonzentration (90 mM), der nicht selektive Kalium – Kanal - Blocker Tetrabutylammonium Chlorid (1 mM) und das Kation – Ionophor Gramicidin (1 µM) verwendet. Die basale endotheliale O2 - - Produktion wurde durch diese Substanzen in ähnlichem Ausmaß (~ 60% ) signifikant gesteigert (n=23, p<0.01). Dagegen senkte die Hyperpolarisation durch Öffnung von KATP Kanälen mittels Hoe 234 (1 mM) signifikant die O2 - - Bildung. Nach Auflösung der zellulären Integrität zeigten zuvor depolarisierte Zellen (1h bzw. 6h ) eine gesteigerte NADH - abhängige O2 - - Bildung, die jedoch nicht mit einem erhöhten mRNA Gehalt von Untereineinheiten der NAD(P)H - Oxidase assoziiert war. Die Depolarisation induzierte sowohl eine gesteigerte Tyrosinphosphorylierung von verschiedenen, bisher noch nicht näher charakterisierten Proteinen (90 - 110 kD), als auch eine signifikante Steigerung der Membranassoziation des G - Proteins rac. Die Inaktivierung von rac unterdrückte dabei den steigernden Effekt der Depolarisation auf die endotheliale O2 - - Bildung. Weiterhin bewirkte die Hemmung von Tyrosinkinasen mit Genistein (30 µM, n=15) sowohl eine Aufhebung der durch Depolarisation gesteigerten O2 - - Bildung als auch der damit assoziierten rac – Translokation. Zusammenfassend kann aus diesen Daten geschlossen werden, daß eine der leukozytären Form ähnliche NADP(H) - Oxidase in humanen Endothelzellen vorhanden ist, bei deren Regulation das kleine G -Protein rac ein wichtige Rolle spielt. Im Gegensatz zu Leukozyten zeigte sich im Endothe l jedoch eine konstitutive, bevorzugt NADH – abhängige, O2 - - Bildung. Membranpotentialänderungen beeinflußten die Aktivität dieser NAD(P)H - Oxidase, wobei durch Depolarisation die endotheliale O2 -- Bildung erhöht und durch Hyperpolarisation mittels Öffnung von K+ ATP Kanälen gesenkt wird. Tyrosinphosphorylierungs - abhängige Signalschritte, sowie die Aktivierung und Translokation der GTPase rac stellen einen entscheidenden Schritt in der Signaltransdukion der durch Depolarisation - gesteigerten O2 - - Bild ung dar.