CRISPR/Cas9-mediated gene editing to analyze the impact of NOTCH1 mutations and their potential as a therapeutic target in mantle cell lymphoma

Donven, Martine (2025): CRISPR/Cas9-mediated gene editing to analyze the impact of NOTCH1 mutations and their potential as a therapeutic target in mantle cell lymphoma. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Mantle cell lymphoma (MCL) is a rare subtype of Non-Hodgkin Lymphoma representing about 5-7% of all Non-Hodgkin lymphomas in Western Europe. Although high initial response rates can be achieved with current standard therapy, early relapses and rapid disease progression determine the clinical course of most MCL patients and prognosis is still poor with an overall survival of only 3-5 years. NOTCH1 gene mutations occur in 5-10% of mantle cell lymphoma (MCL) and are associated with significantly lower survival rates. The majority of these mutations lead to a truncation of the PEST domain, resulting in overactivity of the Notch1-signalling pathway. However, functional relevance of NOTCH1 mutations and its potential as a specific therapeutic target is not fully elucidated. In this study, the CRISPR/Cas9 method was used to modify the PEST domain of the NOTCH1 gene in the MCL cell lines Mino and Jeko-1. The aim was to establish genetically identical cell clones that differ by a single mutation in the PEST domain of their NOTCH1 gene. These clones could further be used to perform experiments analyzing NOTCH1 specific functions that are not confounded by intercellular differences. Additionally, the efficiency of drugs and antibodies targeting NOTCH1 signaling could be tested on the generated cell clones. In the Mino cell line, we attempted to repair the point mutation in the PEST domain of the gene with a homology directed repair (HDR) template, whereas in Jeko-1 cells, harboring the wildtype sequence of the gene, we aimed to introduce a point mutation in the PEST domain through non-homologous end joining (NHEJ). For both cell lines, the introduction of the guide RNA into the CRISPR/Cas9 backbone was successful and an electroporation program was established. However, in the Mino cell line, the repair of the mutation could not be achieved as the CRISPR/Cas9 construct disrupted the growth of the cell clones. Nevertheless, a mutation was successfully introduced into the NOTCH1 gene of the Jeko-1 cells and genetically stable Jeko-1 cell clones harboring a point mutation in the PEST domain of the NOTCH1 gene were created. As assessed by Western Blot analysis, NOTCH1-mutated clones expressed a shorter Notch1 protein due to the mutation in the PEST domain leading to a truncated protein with enhanced stability upon stimulation with DLL4.

Abstract

Das Mantelzelllymphom ist eine seltene Untergruppe der Non-Hodgkin Lymphome, die etwa 5-7% aller Non-Hodgkin Lymphome in Westeuropa darstellt. Inzwischen kann durch eine Behandlung nach den aktuellen Therapiestandards initial ein hohes Behandlungsansprechen erzielt werden, jedoch ist der klinische Verlauf ebenfalls durch eine hohe Frührezidivrate und einen aggressiven Verlauf geprägt. Die Prognose von Patienten mit Mantelzelllymphom ist immer noch schlecht bei einem Gesamtüberleben von nur 3-5 Jahren. NOTCH1 Genmutationen kommen in 5-10% der Mantelzelllymphome vor und sind mit einem signifikant reduzierten Gesamtüberleben assoziiert. Diese Mutationen führen meistens zu einer Verkürzung der PEST-Domäne, was zu einer Überaktivierung des Notch1-Signalweges führt. Die funktionale Bedeutung von Notch1 Mutationen und ihre Bedeutung als Therapieansatz ist noch nicht vollständig erforscht. In dieser Arbeit wurde mithilfe der CRISPR/Cas9 Methode die PEST-Domäne des NOTCH1 Gens in den Mantelzelllymphomzelllinien Mino und Jeko-1 verändert. Ziel war es, genetisch identische Zellreihen zu etablieren, die sich ausschließlich durch eine Veränderung in der PEST-Domäne des NOTCH1 Gens unterscheiden. Diese CRISPR/Cas9 veränderten Zellen können eingesetzt werden, um die Auswirkungen einer NOTCH1 Mutation durch Experimente zu charakterisieren, ohne die Ergebnisse durch interzelluläre Differenzen zu verfälschen. Zusätzlich kann die Wirksamkeit von NOTCH1 Inhibitoren und monoklonalen NOTCH1 Antikörpern an den hergestellten Zellklonen getestet werden. In der Mino Zelllinie war das Ziel, CRISPR/Cas9 basiert die Punktmutation in der PEST-Domäne des NOTCH1 Gens mithilfe homologer Rekombinationsmechanismen (HDR) zu reparieren, wohingegen das Ziel in der Jeko-1 Zelllinie darin bestand, eine Mutation mithilfe nicht-homologer Endverknüpfung (NHEJ) in das wildtypische NOTCH1 Gen einzufügen. Für beide Zelllinien ist es in dieser Arbeit gelungen, passende Guides in ein CRISPR/Cas9 Grundgerüst einzubringen. Außerdem konnte für die anschließende Transfektion mit dem CRISPR/Cas9 Konstrukt erfolgreiche Transfektionsprogramme für diese Zelllinien etabliert werden. Leider konnte in der Mino Zelllinie keine Reparatur der Mutation erzielt werden, da das CRISPR/Cas9 Konstrukt das Zellwachstum negativ beeinflusst. In den Jeko-1 Zelllinien konnte allerdings erfolgreich eine Mutation in die PEST-Domäne des NOTCH1 Gens eingefügt werden, sodass genetisch stabile Jeko-1 Klone mit einer potenten NOTCH1 Mutation hergestellt werden konnten. In der Westernblotanalyse zeigten die NOTCH1-mutierten Klone ein verkürztes Notch1 Protein aufgrund der verkürzten PEST-Domäne mit erhöhter Stabilität nach DLL4 Stimulation.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Mantle cell lymphoma, NOTCH1, PEST, CRISPR/Cas9, DLL4
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 24. Juli 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Dreyling, Martin