Untersuchung der zelltypspezifischen Lokalisation und Funktion des P2X7-Rezeptors im enterischen Nervensystem in einem BAC transgenen P2X7R-EGFP Reportermausmodell

Jooß, Tina Natalie (2025): Untersuchung der zelltypspezifischen Lokalisation und Funktion des P2X7-Rezeptors im enterischen Nervensystem in einem BAC transgenen P2X7R-EGFP Reportermausmodell. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Der P2X7-Rezeptor (P2X7R) ist ein durch ATP aktivierter Kationenkanal [1]. Er wird durch Zellen des angeborenen und adaptiven Immunsystems exprimiert [37, 106, 118, 257, 263] und spielt eine wichtige Rolle bei entzündlichen Prozessen [50]. Die Aktivierung des P2X7R führt u.a. zur Zusammenlagerung des NLRP3-Inflammasom, zur Freisetzung von proinflammatorischen Zytokinen wie IL-1ß [18, 37-41] und kann zum Zelltod durch Apoptose führen [18, 54, 57, 264]. Die Beteiligung des P2X7R an der Pathogenese von chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen (CED) konnte in verschiedenen CED-Modellen gezeigt werden [105, 235, 236]. Der P2X7R Antagonist AZD9056 verbesserte in einer Phase IIa Studie mit einer kleinen Gruppe von an Morbus Crohn erkrankter Patienten die klinische Symptomatik [237]. Während die P2X7R Lokalisation und Funktion in Neuronen des ZNS umstritten ist [76], wurde die Lokalisation in Neuronen des Plexus myentericus und des Plexus submucosus mehrfach beschrieben [99, 231, 258, 259]. Diesbezüglich wird angenommen, dass der Untergang enterischer Neuronen während einer Colitis und die damit verbundenen enteralen Motilitätsstörungen durch die Aktivierung neuronaler P2X7R vermittelt wird [99, 231, 265]. Um die zelltypspezifische Lokalisation und Funktion des P2X7R im enterischen Nervensystem (ENS) näher zu untersuchen, wurden in der vorliegenden Arbeit zunächst verschiedene Colonpräparationen eines BAC-transgenen P2X7R-EGFP-Mausmodells mittels EGFP- und P2X7R-spezifischen Antikörpern sowie eines P2X7R-spezifischen Nanobodies analysiert und mit dem Wildtyp (wt) verglichen. Die Immunfluoreszenzuntersuchungen von Colonquerschnitten, LMMP (longitudinal muscle myenteric plexus)-Präparationen, Präparationen des Plexus submucosus sowie planarer Mukosapräparationen zeigten die P2X7R- und EGFP-Expression in Enterozyten, Zellen der Lamina propria und in der Muscularis externa. Mittels Durchflusszytometrie konnte die Vergleichbarkeit der P2X7R-Expression in Immunzellen von wt und transgenen Mäusen gezeigt werden. Weiterhin wurden übereinstimmende Expressionsmuster in LMMP-Präparationen von wt und transgenen Mäusen demonstriert und die Spezifität der Antikörper und des Nanobodies durch knockout-Kontrollen belegt. In weiteren Untersuchungen wurden Co-Färbungen mit Antikörpern für verschiedene Markerproteine (Neuronen, ICC, Gliazellen, Mastzellen und Makrophagen) durchgeführt. Im Gegensatz zu früheren Studien [99, 231, 258, 259] zeigten diese Untersuchungen keine P2X7R Lokalisation in Neuronen des Plexus myentericus und des Plexus submucosus, sondern eine dominante P2X7R Expression und Synthese durch S-100ß positive Gliazellen sowie durch F4/80 und CD68 positive Makrophagen. Ferner konnten hierbei zwei unterschiedliche Makrophagentypen differenziert werden, die sich hinsichtlich ihrer Lokalisation, Morphologie und der IBA-1 Expression und Synthese unterscheiden. Die Quantifizierung der F4/80 positiven Makrophagen ergab eine um 40% erhöhte Makrophagenanzahl im transgenen P2X7R-EGFP-Mausmodell im Vergleich zum wt und in diesen Zellen konnte interessanterweise auch der Proliferationsmarker Ki-67 nachgewiesen werden. Schließlich wurde untersucht, ob eine neuronale P2X7R-Expression und Synthese unter pathophysiologischen Bedingungen induziert werden kann und ob die P2X7R-Überexpression im P2X7R-EGFP-Mausmodell mit einer höheren Suszeptibilität bei Induktion einer Colitis einhergeht. In einem ex vivo Modell führte die Applikation des physiologischen Agonisten ATP zu keiner nachweisbaren neuronalen P2X7R Expression und Synthese des Plexus myentericus, jedoch zu einer verminderten Neuronenanzahl in Übereinstimmung mit früheren Beobachtungen [99]. Die Quantifizierung der Neuronenanzahl im ex vivo Modell nach Applikation des selektiveren P2X7R Agonisten BzATP, zeigte eine geringere Anzahl an Neuronen im P2X7R-EGFP-Mausmodell und wt im Vergleich zum P2rx7-/--Mausmodell, die jedoch nicht signifikant war. Nach in vivo Colitis-Induktion mittels DSS sowie im T-Zell-Transfer-Colitismodell, konnte ebenfalls keine P2X7R-Hochregulation nachgewiesen werden. Die Überexpression des P2X7R im P2X7R-EGFP-Mausmodell führte im DSS-Colitismodell zudem zu keinen signifikanten Unterschieden im Vergleich zum wt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass der P2X7R im ENS vor allem durch Makrophagen und S-100β-positiven Gliazellen exprimiert wird. Die ATP-induzierte neuronale Schädigung des ENS ist somit wahrscheinlich ein indirekter Effekt der P2X7R Aktivierung in Makrophagen und/oder Gliazellen. Dies ähnelt der Situation im ZNS, wo P2X7R in hohem Maße von Mikroglia und S-100β-positiven Astrozyten exprimiert werden. Interessanterweise ähneln Mikroglia im ZNS in vielerlei Hinsicht den Makrophagen im ENS [266]. Zusammenfassend liefern die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit eine wichtige Grundlage zum Verständnis der physiologischen und pathophysiologischen P2X7R-Funktionen und seine Validierung als Zielstruktur für die Entwicklung neuartiger Arzneistoffe zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: P2X7R, ENS
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 26. Juni 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Nicke, Annette