In vivo analysis and therapeutic targeting of calcium-mediated axonal degeneration in a multiple sclerosis model

Beckmann, Daniela (2025): In vivo analysis and therapeutic targeting of calcium-mediated axonal degeneration in a multiple sclerosis model. Dissertation, LMU München: Graduate School of Systemic Neurosciences (GSN)

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory, demyelinating and degenerative disease of the central nervous system (CNS), characterised by the formation of focal inflammatory lesions and additional damage due to smouldering low-grade CNS inflammation. The clinical manifestation of relapsing-remitting MS – the rapid appearance of new neurological symptoms – is likely caused by acute inflammation and demyelination. The extent of long-term, irreversible disability, however, is determined by neurodegeneration, especially loss of axons. This degeneration is observable from the earliest stages of the disease and causes progressive disability once a critical compensable threshold is passed. Currently available immunomodulatory treatments for MS suppress relapses but cannot completely halt neuroaxonal degeneration. The development of primary neuroprotective treatments is therefore an important unmet clinical need. In vivo imaging in experimental autoimmune encephalomyelitis, an animal model of MS, is a powerful tool to study the pathogenesis of axonal degeneration. Such experiments have shown that initial axonal damage is still reversible and that the likelihood of fragmentation of damaged axons is determined by intra-axonal calcium, which enters through “nanoruptures” in the plasma membrane. As some axons can re-establish calcium homeostasis spontaneously, we hypothesised that therapeutic interventions, which support axons in regaining calcium homeostasis will shift the balance in favour of recovery and reduce axonal loss. The aim of this thesis was therefore to explore calcium modulation for axoprotective therapy by (1) exploiting endogenous calcium homeostatic pathways and (2) developing an exogenous calcium chelation approach, selectively targeted to injured axons, to prevent side effects on physiological calcium signalling. The basis of the selective targeting approach was to deliver a prodrug calcium chelator via the membrane “nanoruptures” that characterise damaged, high-calcium axons. As a proof-of-principle we first delivered fluorogenic compounds across damaged plasma membranes, thereby developing a membrane damage sensor, that is applicable across different cell types and in different types of membrane damage. The cytosolic localisation of the biosensor also makes it useful for targeting axons, which contrasts with nuclear DNA-binding stains such as propidium iodide. First steps of translating these findings into prodrug development have also been taken. To enhance endogenous calcium buffering, we performed experiments of rAAV-mediated, neuron-specific overexpression of the cytosolic calcium-binding proteins calbindin and calretinin. Despite optimisation attempts, the axonal expression achieved with this approach was low and did not reduce intra-axonal calcium levels or the degree of axonal loss in an MS animal model. Further improvement of the overexpression approach will be necessary to assess the axoprotective potential of calcium-binding protein overexpression. In summary, this thesis lays foundational work to address the suitability of calcium as a neuroprotective target by developing a selective targeting approach to membrane-damaged axons and by evaluating an experimental approach for rAAV-mediated axonal overexpression of calcium-binding proteins.

Abstract

Die Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische, entzündliche, demyelinisierende und degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), welche durch die Entstehung fokaler Entzündungsherde sowie durch eine progrediente diffuse Gewebsschädigung aufgrund eines niedrig-gradig schwelenden Entzündungsprozesses charakterisiert ist. Es wird angenommen, dass die klinische Manifestation der schubförmig remittierenden MS – die akut auftretenden neurologischen Ausfälle – durch die Entzündung und Demyelinisierung ausgelöst werden. Das Ausmaß der langfristigen und irreversiblen Behinderung hingegen wird durch die Neurodegeneration bestimmt, insbesondere durch den Verlust von Axonen. Diese Degeneration ist in den frühesten Stadien der Krankheit beobachtbar und verursacht eine fortschreitende Behinderung, sobald eine kritische, kompensierbare Schwelle überschritten wird. Die derzeit verfügbaren immunmodulatorischen Therapien für MS unterdrücken Krankheitsschübe, können aber die neuroaxonale Degeneration nicht vollständig aufhalten. Die Entwicklung primär neuroprotektiver Therapien ist daher dringend notwendig. In vivo mikroskopische Untersuchungen der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis, einem Tiermodell der MS, sind ein hilfreicher Ansatz, um die Pathogenese der axonalen Degeneration zu verstehen. Experimente dieser Art haben gezeigt, dass die anfängliche Schädigung der Axone noch reversibel ist und, dass die Wahrscheinlichkeit der Fragmentierung geschädigter Axone von der Konzentration des intra-axonalen Calciums abhängt, welches durch „Nanorupturen“ in der Plasmamembran eintritt. Da manche Axone ihre Calcium-Homöostase spontan wiederherstellen können, stellten wir die Hypothese auf, dass therapeutische Interventionen, welche Axone darin unterstützen ihre Calcium-Homöostase wiederherzustellen, die Balance zugunsten einer axonalen Erholung verschieben und den Verlust von Axonen verringern können. Das Ziel dieser Arbeit war es daher die Modulierung von Calcium als mögliche axoprotektive Therapiestrategie zu untersuchen. Dies erfolgte durch zwei verschieden Ansätze: (1) Durch die Ausnutzung endogener Mechanismen der Calcium-Homöostase und (2) durch die Entwicklung eines exogenen Calcium-Komplexierungsansatzes, welcher selektiv auf geschädigte Axone abzielt. Dies sollte Nebenwirkungen auf physiologische Calcium-Signale vermeiden. Grundlage dieses Ansatzes war es, einen Calcium Chelator als Propharmakon durch jene „Nanorupturen“ einzuschleusen, welche geschädigte Axone mit erhöhtem Calcium charakterisieren. In einer Machbarkeitsstudie schleusten wir dazu zunächst fluorogene Stoffe über die geschädigte Plasmamembran ein und entwickelten so einen Membranschädigungs-Sensor, der in verschiedenen Zelltypen und für verschiedene Arten der Membranschädigung einsetzbar ist. Die zytosolische Lokalisierung des Biosensors macht ihn auch für die Darstellung von Axonen nützlich, im Gegensatz etwa zu Propidiumiodid, einem Farbstoff, welcher lediglich die DNA im Zellkern färbt. Erste Schritte zur Übertragung dieser Erkenntnisse auf die Entwicklung eines Calcium-puffernden Propharmakons wurden ebenfalls unternommen. Um die endogene Calcium-Pufferung zu unterstützen, wurden zudem Experimente zur rAAV-vermittelten, Neuron-spezifischen Überexpression der zytosolischen Calcium-bindenden Proteine Calbindin und Calretinin durchgeführt. Trotz mehrerer Optimierungsversuche war die so erreichte axonale Überexpression jedoch gering und konnte weder die intra-axonale Calcium-Konzentration noch den Verlust von Axonen in einem Tiermodell der MS reduzieren. Eine weitere Verbesserung des Überexpressions-Ansatzes wird notwendig sein, um das axoprotektive Potential Calcium-bindender Proteine zu untersuchen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit grundlegende Vorarbeiten zur Entwicklung neuroprotektiver Therapiestrategien, die an den erhöhten intraaxonalen Calciumkonzentrationen ansetzen, geleistet hat. Dies tut sie durch die Entwicklung einer selektive Zulieferungsmethode in membrangeschädigte Axone sowie durch die Evaluation eines experimentellen Ansatzes für die axonale rAAV-vermittelte Überexpression Calcium-bindender Proteine.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Multiple Sclerosis, Neuroinflammation, Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE), Axonal Degeneration, Axonal Injury, Neuroprotection, Calcium, Calcium-binding Proteins, In Vivo Imaging, Plasma Membrane Damage, Biosensor
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Graduate School of Systemic Neurosciences (GSN)
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 15. April 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Kerschensteiner, Martin