Characterization of novel NEDDylation inhibitors in in vitro models of atherogenesis

Preuner, Eva-Maria (2025): Characterization of novel NEDDylation inhibitors in in vitro models of atherogenesis. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Intracellular protein degradation is controlled by the ubiquitin-proteasome system (UPS) through post-translational modification of target proteins with ubiquitin. The central components of the UPS are cullin-RING ligases (CRLs). The CRLs’ ubiquitin ligase activity is regulated by post-translational modification with NEDD8 (neural precursor cells expressed developmentally downregulated-8), a protein structurally similar to ubiquitin. NEDDylation impacts cell homeostasis, cell death, and physiological cell functions by mediating the degradation of critical regulatory proteins. Especially the CSN (constitutive photomorphogenesis 9 (COP9) signalosome), which catalyzes the removal of NEDD8, is considered a promising therapeutical target in cancer research. Still, various studies indicate that the CSN also has a central role in inflammation and atherosclerosis. Recent efforts have identified multiple compounds that negatively impact NEDDylation. These compounds, at least partially, mimic, and consequently allow to study the CSN. MLN4924, which affects the E1 enzyme and therefore fully blocks NEDDylation, is atheroprotective in vivo and in vitro. To target cullin-NEDDylation more specifically, novel defective in cullin NEDDylation protein 1 (DCN1) inhibitors, which impair a later timepoint in the NEDDylation cascade, have been developed. This thesis evaluated the effects of the novel DCN1 inhibitors NAcM-OPT and -COV, which had only been applied in cancer cell models so far, in murine and human monocyte and macrophage models in the context of atherosclerosis in vitro. The results suggested a less pronounced impact on CUL1- and CUL3-NEDDylation levels compared to MLN4924 in vitro. Still, the covalently binding NAcM-COV resulted in a more potent reduction of cullin-NEDDylation than the non-covalently binding NAcM-OPT. The atheroprotective effect of MLN4924 on macrophage protein secretion in vitro could not be observed when using the novel DCN1 inhibitors. Interestingly, treatment with NAcM-COV and MLN4924 significantly impaired monocyte mobility and viability in vitro. This study provided first insights into the effectiveness of the novel DCN1 inhibitors on murine and human monocyte and macrophage models in the context of atherogenesis in vitro. This thesis pinpointed novel DCN1 inhibitors as a promising addition to the research of the CSN as they allow insight into specifically targeting CUL1- and CUL3-NEDDylation. These more specific inhibitors of NEDDylation could be future therapeutic alternatives to MLN4924 as they might result in fewer side effects.

Abstract

Das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) steuert den intrazellulären Proteinabbau durch posttranslationale Modifikation der Zielproteine mit Ubiquitin. Die zentralen Schaltstellen des UPS sind Cullin-RING-Ligasen (CRLs), deren Ubiquitin-Ligase-Aktivität durch NEDD8 (neural precursor cells expressed developmentally downregulated-8) reguliert wird. Die NEDDylierung beeinflusst die Zellhomöostase und physiologische Zellfunktionen, indem sie den Abbau regulatorischer Proteine vermittelt. Das CSN (constitutive photomorphogenesis 9 (COP9) signalosome), welches die Entfernung von NEDD8 katalysiert, gilt daher als vielversprechendes therapeutisches Ziel in der Krebsforschung. Des Weiteren deuten verschiedene Studien darauf hin, dass das CSN auch bei Entzündungen und Atherosklerose eine wichtige Rolle spielt. In den letzten Jahren wurden mehrere Verbindungen identifiziert, die die NEDDylierung inhibieren und somit zumindest teilweise die Aktivität des CSN widerspiegeln. MLN4924, ein Inhibitor welcher die gesamte NEDDylierung blockiert, wirkt in vivo und in vitro atheroprotektiv. DCN1 (defective in cullin NEDDylation protein 1) Inhibitoren, die einen späteren Zeitpunkt in der NEDDylierungskaskade beeinträchtigen und nicht die NEDDylierung aller Culline beeinflussen, ermöglichen es, den Einfluss der Cullin-NEDDylierung gezielter zu erforschen. In dieser Arbeit wurden die Wirkungen der neuartigen DCN1 Inhibitoren NAcM-OPT und -COV, welche bis dato nur an Krebszellmodellen getestet wurden, in murinen und humanen Monozyten- und Makrophagenmodellen in vitro im Kontext atherosklerotischer Entzündungsprozesse evaluiert. Die Ergebnisse deuteten auf einen weniger ausgeprägten Einfluss auf die CUL1- und CUL3-NEDDylierung im Vergleich zu MLN4924 hin. Dennoch führte das kovalent bindende NAcM-COV zu einer stärkeren Reduktion der Cullin-NEDDylierung als das nicht kovalent bindende NAcM-OPT. Die starke atheroprotektive Wirkung von MLN4924 auf die Sekretion inflammatorischer Mediatoren aus Makrophagen in vitro wurde mit den neuen DCN1 Inhibitoren nicht beobachtet. Interessanterweise beeinträchtigte die Behandlung mit NAcM-COV und MLN4924 die Mobilität und Vitalität der Monozyten in vitro. Zusammenfassend lieferte diese Dissertation erste Einblicke in die Wirksamkeit der neuartigen DCN1 Inhibitoren an murinen und menschlichen Monozyten- und Makrophagenmodellen im Kontext der Atherogenese in vitro. Hierbei wurden die neuartigen DCN1 Inhibitoren als vielversprechende Ergänzung der Erforschung des CSN identifiziert, da sie Einblicke in die gezielte Regulation der CUL1- und CUL3-NEDDylierung ermöglichen. Perspektivisch könnten sich spezifischere NEDDylierungsinhibitoren auch als nebenwirkungsärmere therapeutische Alternativen zu MLN4924 etablieren.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: COP9 signalosome, DCN1 inhibitors, NEDDylation, inflammation, atherosclerosis
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 30. Januar 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Bernhagen, Jürgen