Aktivitätsbasierte Quantifizierung der Granula-assoziierten Serinproteasen Neutrophiler Granulozyten

Riedlinger, Eva (2025): Aktivitätsbasierte Quantifizierung der Granula-assoziierten Serinproteasen Neutrophiler Granulozyten. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Neutrophile Granulozyten sind der myeloischen Zellreihe entstammende Immunzellen, die essenzielle Effektoren der angeborenen Immunantwort sind, aber auch maßgeblich zu Entzündungsprozessen beitragen. Wesentliche Bestandteile sind die Serinproteasen Neutrophilen Elastase (HNE), Proteinase 3 (PR3), Cathepsin G (CathG) und Neutrophilen Proteinase 4 (NSP4), die auf Grund phylogenetischer und struktureller Gemeinsamkeiten den „Granula-Associated Serine Proteases of Immune Defense“ (GASPIDs) zugerechnet werden. Während der Granulopoese werden sie als Zymogene synthetisiert, durch die Cysteinprotease Cathepsin C (CathC) prozessiert und anschließend in enzymatisch aktiver Form in azurophilen Granula gespeichert. Da die Synthese ausschließlich während der Zellreifung im Knochenmark erfolgt verfügen im Blut zirkulierende Neutrophile Granulozyten über eine festgelegte Ausstattung dieser Proteasen. Ziel dieser Arbeit war es, die in peripheren Neutrophilen enthaltenen Mengen der GASPIDs HNE, PR3, CathG und ihres Aktivators CathC mittels klassischer enzymkinetischer Assays zu quantifizieren. Ausgehend von Peptidsubstraten, die zum Nachweis der GASPIDs identifiziert worden waren, wurden zunächst aktivitäts-basierte Assays etabliert und hinsichtlich der Quantifizierung validiert. Beim Einsatz isolierter Proteasen ist die gemessene Aktivität in allen vier Assays direkt proportional zur eingesetzten Enzymkonzentration (r2 > 0,99), die unteren Nachweisgrenzen liegen dabei jeweils im subnanomolaren Bereich (< 0,5 nM). Technische Störfaktoren während der Messungen können anhand der Beobachtung des linearen Anstiegs des Substratumsatzes über die Zeit (r2 > 0,90) ausgeschlossen werden. Da Peptidsubstrate nicht völlig spezifisch sind wurde für jede der Proteasen ein selektiver Inhibitor identifiziert, mit dem die Aktivität zusätzlich auf die jeweilige Protease zurückgeführt werden kann (Restaktivität < 3 %). Im nächsten Schritt wurde die Übertragbarkeit der Assays auf Zelllysate untersucht. Dazu wurden Neutrophile Granulozyten mittels immunomagnetischer Depletion anderer Zellen aus Vollblut isoliert und mit tensidhaltigen Puffern lysiert. In diesen Lysaten ist die Aktivitätsmessung aller vier Proteasen problemlos möglich; beim Einsatz von ~ 100 bis 40.000 Zellen ist die Aktivität linear von der eingesetzten Zellzahl abhängig (r2 > 96). Matrixeffekte werden nicht beobachtet. Die Beeinflussung der Assays durch andere in den Lysaten vorhandene Enzyme wurde mithilfe der zuvor etablierten selektiven Inhibitoren weitgehend ausgeschlossen (Restaktivität < 10 %). Bei vergleichsweise hoher Ausbeute der Isolation (55 ± 10 %) und Reinheit der Leukozytenpopulation (99 ± 0,5 Neutrophile/100 Leukozyten) verblieben trotz zweimaliger hypotoner Lyse im Mittel 18 ± 21 Erythrozyten pro 100 Leukozyten. Deshalb durchgeführte Untersuchungen zum Einfluss von Hämoglobin zeigen, dass die Zugabe von > 0,1 mg/dl Hämoglobin die gemessene Aktivität von PR3 im PR3-Assay reduziert; die HNE-, CathG- und CathC-Assays werden dagegen auch durch 10-fach höhere Hb-Konzentrationen (1 mg/dl) nicht beeinflusst. Bei der Bestimmung in Neutrophilen-Lysaten korrelieren hohe Hb-Konzentrationen allerdings nicht mit niedrigen PR3-Werten (r < 0,19; p = 0,32), sodass ein relevanter Einfluss auf die Quantifizierung hier weitgehend ausgeschlossen ist. Nach Abschluss der Validierung wurden die Assays zur Analyse der Lysatproben von 28 Probanden (Alter 24 ± 4,4 Jahre) verwendet. Die Aktivität aller vier Proteasen konnte erfolgreich in allen Proben quantifiziert und somit erstmals der intrazelluläre Gehalt der GASPIDs und von CathC in einer größeren Probandenkohorte bestimmt werden. Im Mittel enthielten die Neutrophilen Granulozyten 0,5 ± 0,2 pg HNE, 0,8 ± 0,3 pg PR3, 0,6 ± 0,2 pg CathG und 0,2 ± 0,07 pg CathC pro Zelle (MW ± SD, n = 28). Die Messwerte zeigen deutliche interindividuelle Unterschiede, die bei der PR3-Bestimmung am ausgeprägtesten sind (PR3 0,3 - 1,4 pg, HNE 0,2 - 0,9 pg, CathG 0,2 - 0,9 pg, CathC 0,07 - 0,34 pg). Insbesondere wurden signifikant geringere Mengen aller vier Proteasen bei Probandinnen im Vergleich zu Probanden nachgewiesen (z.B. CathG weiblich 0,5 ± 0,2 pg, männlich 0,7 ± 0,2 pg, MW ± SD). Korrelationen der GASPIDs untereinander und mit ihrer Aktivatorprotease Cathepsin C ergeben eine positive Abhängigkeit (r > 0,5 bzw. 0,55; p = 0,006 bzw. 0,002). Kein relevanter Zusammenhang hingegen besteht zur Myeloperoxidase, einer weiteren in azurophilen Granula enthaltenen Protease (r < 0,29; p = 0,29). Insgesamt zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die hier etablierten Assays einen technisch einfachen und gleichzeitig präzisen Ansatz für die Quantifizierung der GASPIDs und ihres Aktivators in zirkulierenden Neutrophilen Granulozyten bieten. Diese Assays scheinen – ggf. nach weiterer Optimierung der Handhabbarkeit – geeignet zu sein, um die aufgezeigten interindividuellen und geschlechtsspezifischen Unterschiede an einem größeren Kollektiv näher zu analysieren und mögliche Variationen im Zusammenhang mit GASPID-assoziierten Erkrankungen aufzudecken. Diese Untersuchungen werden zeigen, inwieweit die GASPIDs als unabhängige Biomarker für diagnostische und prognostische Zwecke eingesetzt werden können.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Neutrophile Serinproteasen, Neutrophilen Elastase, Proteinase 3, Cathepsin G, Cathepsin C
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 13. Februar 2025
• 1. Bericht­erstatter:in: Sommerhoff, Christian