An investigation of prime editing kinetics

Schäffler, Nathalie (2024): An investigation of prime editing kinetics: physical foundations towards realizing efficient biocomputing. Dissertation, LMU München: Fakultät für Physik

Abstract

DNA spielt eine grundlegende Rolle in lebenden Systemen, indem sie genetische Informationen speichert und reguliert. Neue Entwicklungen wie Prime Editing ermöglichen präzise Modifikationen der Basenpaare des Genoms und versprechen damit verbesserte Therapien für genetische bedingte Krankheiten. Die gezielte Veränderung einer genetischen Sequenz könnte außerdem eine wichtige Rolle bei der Entwicklung DNA-basierter Rechensysteme spielen. Viele Publikationen konzentrieren sich aktuell hauptsächlich auf die Verbesserung der Effizienz von Prime Editing durch Optimierung von Proteinen, pegRNAs und Transfektionsmethoden. In diesen Studien wird die Effizienz eines Editing-Schritts meist jedoch erst nach mehreren Tagen gemessen, was für Anwendungen wie biologische Computer zu ungenau ist. Um die Kinetik von Prime Editing optimieren zu können, ist das Ziel dieser Arbeit sie erstmals mithilfe von experimentellen Methoden und mathematischen Modellen präzier zu quantifizieren. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wird die ”Live Imaging on Single-Cell Arrays”-Methodik benutzt, um Prime-Editing-Ereignisse anhand der Verteilung von Einzelzelldaten zu charakterisieren. Zunächst wird gezeigt, dass der Beginn eines Fluoreszenzsignals nach Transfektion mittels mRNA-Transfektion 13 h schneller erfolgte als über Plasmid-DNA (pDNA). Mit einer Zelllinie, die einen Fluoreszenzreporter exprimiert, welcher nur nach erfolgreichem Prime Editing grünes Licht emitieren kann, wird die ”time-to-edit”, die Zeit von der Transfektion der Prime-Editing-Komponenten bis zum Einsetzen der Fluoreszenz, bestimmt. Der Vergleich von mRNA- und pDNATransfektion des Prime Editing Systems zeigt, dass die mRNA-Transfektion 7 h schneller war als die pDNA-Transfektion, aber auch zu geringerer Effizienz führte. Die ”editing time”, also die Zeit von der Expression des Prime-Editing-Komplexes bis zum Einsetzen der Fluoreszenz, ist bei mRNA-basierter Transfektion 15 mal langsamer als über pDNA. In dieser Arbeit wird außerdem gezeigt, dass in Übereinstimmung mit der ”branch-migration”-Theorie längere Edits quadratisch mit längeren Editing-Zeiten korrelieren. Durch mathematische Modellierung wurden limitierende Parameter, wie das Transfektionsverhältnis von pegRNA zu Prime-Editor-mRNA, extrahiert und die Genauigkeit verschiedener Expressionsmodelle bewertet. Basierend auf der ”search-and-replace” Operation, ermöglicht durch Prime Editing, wird abschließend ein theoretischer Rahmen für die Implementierung von Teilen des SKI-Kombinator Kalküls, eine reduzierte Form des Lambda Kalküls, vorgeschlagen. Für diese theoretische Implementierung sind jedoch eine genaue Reihenfolge und Präzision der Operationen notwendig. Inwieweit diese Voraussetzungen in einer experimentellen Implementierung sichergestellt werden können, muss verifiziert werden. Insgesamt tragen die in dieser Arbeit erstmalig erstellten Prime Editing Modelle und Vergleiche mit experimentellen Daten zum besseren Verständnis der Kinetik bei und unterstreichen, wie wichtig es ist, bei der Optimierung dieser Technik nicht nur die Effizienz, sondern auch die Kinetik zu berücksichtigen. Die hier präsentierten Ergebnisse bieten mögliche Ansätze für Informationsverarbeitung mithilfe von DNA, was eine Grundvoraussetzung für zukünftige, DNA-basierte Computer darstellt. Darüber hinaus können diese Erkenntnisse zur Kinetik auch in weiteren Bereichen, beispielsweise in der Arzneimittelforschung, von Nutzen sein.

Abstract

DNA plays a fundamental role in living systems for storing and regulating genetic information. Recent scientific advancements such as prime editing allow precise modifications of base pairs on the genome, which promises to improve gene therapy. The possibility of precisely changing DNA sequences may also play a significant role in the development of advanced biological computing systems. Current research focuses primarily on prime editing efficiency through better protein engineering, pegRNA design, and delivery methods. In these studies, a single editing step is measured only after several days, which is to inaccurate for applications like biocomputing. Quantifying the kinetics of prime editing more precisely is therefore important for optimizing this process. Furthermore, controlling the kinetics of gene editor expression can enhance the safety and efficacy of targeted therapies for genetic diseases, where either prolonged or short-term expression may be preferable. Optimizing the timing of these edits could help minimize off-target effects, for example, and improve therapeutic outcomes. This thesis aims to address this gap using a combination of experimental methods and mathematical models. In the first study, the "Live Imaging on Single-cell Arrays" assay is used to characterize prime editing events based on the distribution of single-cell data. First, it is demonstrated that transfection of fluorescent reporters via mRNA is 13h faster than using pDNA. This approach is then used to monitor the kinetics of prime editing in real-time by employing a modified cell line, capable of expressing fluorescence only after successful prime editing. The time-to-edit is defined as the time from transfection of the prime editing components to the onset of fluorescence. The comparison between mRNA and pDNA delivery shows that mRNA delivery is 7h faster than pDNA but resulted in reduced efficiency. Measuring the time from the expression of the Prime Editing complex to the onset of fluorescence, so the editing time itself, showed that this is 15 times slower for mRNA transfection than for pDNA transfection. This study also indicates that longer edits correlated with longer editing times, consistent with branch migration theory. Through mathematical modeling, limiting parameters were extracted for mRNA-based delivery, such as the initial ratio of delivered pegRNA to prime editor mRNA, and the accuracy of different expression models was evaluated. Finally, based on the "search-and-replace" operation provided by prime editing, a theoretical framework for the implementation of parts of the SKI combinator calculus, a reduced form of the lambda calculus, is proposed. However, this theoretical implementation requires exact sequence and precision of operations. Whether these requirements can be ensured in an experimental implementation should be verified. In conclusion, the novel prime editing models developed in this study, alongside comparisons with experimental data, contribute to a better understanding of prime editing and highlight the importance of considering not only efficiency but also kinetics when optimizing this technique. The results presented here offer possible approaches for information processing using DNA, which is a prerequisite for future DNA-based computers. In addition, these findings on kinetics can also be useful in other areas, such as drug delivery research.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: prime editing, kinetics, gene editing, modeling, crispr, plasmid, mrna, transfection, delivery, nucleic acids
• Themengebiete: 500 Naturwissenschaften und Mathematik ; 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik
• Fakultäten: Fakultät für Physik
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 29. November 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Rädler, Joachim