Untersuchung von Kontraktionskraftveränderungen humaner Myokardslices in biomimetischer Langzeitkultur auf Katecholaminabhängigkeit

Reiser, Elisabeth (2024): Untersuchung von Kontraktionskraftveränderungen humaner Myokardslices in biomimetischer Langzeitkultur auf Katecholaminabhängigkeit. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Research on cardiovascular diseases employs various myocardial models, implicating individual advantages and disadvantages. In the present work, a long-term culture for 300 µm thick myocardial slices from failing left ventricular human myocardium in a biomimetic culture model optimised for this purpose will be presented. During the culture period of 21 days, the contraction force of the slices was measured after electrical stimulation. A characteristic course of the contraction force was observed, with a decrease of approx. 95 % within the first 12 h in culture, followed by a subsequent increase during the next weeks of culture. In order to investigate the possible causes of these effects, the force measurements were complemented by the data acquisition of electromechanically relevant parameters of the myocardium (refractory period, electrical stimulation threshold, force-frequency-relationship, maximum frequency) and the determination of protein quantities and phosphorylation of various contractile and regulatory proteins using Western blots. The central question was whether the observed effects were triggered by the absence of catecholamine stimulation in the culture. To test this question, either the β1-agonist denopamine in two different doses or the β-blocker metoprolol were added to some specimens. As a non-failing comparison group, myocardium from baboons that received a xenotransplantation with pig hearts was also examined in the same way. The results of the investigations showed that a catecholamine deficiency with consecutive negative inotropy was present at the beginning of the culture, but was not solely responsible for the loss of strength of the human failing myocardium, as this could be attenuated but not prevented by adrenergic stimulation using denopamine. Based on a degradation of SERCA2a and phsopholamban, a so-called “myocardial stunning” as an ischaemia-reperfusion reaction without functional damage to the myocardium appeared to play a greater causal role for the loss of strength. In the further course of culture, the myocardial slices recovered from this state with re-expression of the degraded proteins and the preparations treated with denopamine showed a positive inotropic effect and a shortening of the refractory period, as was to be expected. For the non-failing baboon myocardial preparations, the effects in the course of the contraction force measurement were much faster and generally attenuated, before a slow decrease of the force occurred again. This demonstrated that the effects observed for human myocardium were not purely adaptive reactions to the culture. It was also shown that “myocardial stunning” was not present in the baboon preparations, so that a catecholamine deficiency seemed likely as the primary cause of the strength curve. The main reason for the differences in the baboon myocardium may have been the non-failing initial state of the baboon tissue. Further interesting effects observed were a clear decrease in the phosphorylation of phospholamban at the amino acid Ser-16 for all preparations as well as the force-frequency-relationship of the myocardial slices becoming more and more positive, an effect accompanied by an increased phosphorylation at Thr 17 of phospholamban. Research into the causes of these observations, as well as further investigations of the above-mentioned effects, e.g. by means of mRNA transcription data, open up opportunities for further studies, which would also be conceivable on a larger scale with the culture technique presented.

Abstract

In der Forschung an kardiovaskulären Erkrankungen wird mit verschiedenen Myokardmodellen gearbeitet, die vielfältige Vor- und Nachteile bieten. In der vorliegenden Arbeit soll eine Langzeitkultur für 300 µm dicke Myokardslices aus insuffizientem linksventrikulärem humanem Myokard in einem dafür optimierten biomimetischen Kulturmodell vorgestellt werden. Während der Kulturdauer von 21 Tagen erfolgten Messungen der Kontraktionskraft der Slices nach elektrischer Stimulation. Hierbei fiel ein charakteristischer Verlauf der Kontraktionskraft mit einem Abfall um ca. 95 % in den ersten 12 h in Kultur mit anschließend folgendem Wiederanstieg in den nächsten Wochen der Kultur auf. Um die möglichen Ursachen dieser Effekte zu untersuchen, wurden die Kraftmessungen um die Erhebung elektromechanisch relevanter Kenngrößen des Myokards (Refraktärzeit, elektrische Reizschwelle, Kraft-Frequenz-Abhängigkeit, Maximalfrequenz) und die Bestimmung von Proteinmengen und Phosphorylierungen verschiedener kontraktiler und regulatorischer Proteine mittels Western-Blots ergänzt. Dabei lag der Fokus auf der Fragestellung, ob die beobachteten Effekte durch das Fehlen einer Katecholaminstimulation in der Kultur ausgelöst wurden. Zur Überprüfung dieser Fragestellung wurden einigen Präparaten entweder der β1-Agonist Denopamin in zwei verschiedenen Dosierungen oder der β-Blocker Metoprolol zugesetzt. Als nicht insuffiziente Vergleichsgruppe wurde zudem Myokard von Pavianen, die eine Xenotrans-plantation mit Schweineherzen erhielten, in gleicher Weise untersucht. Die Resultate der Untersuchungen konnten zeigen, dass zu Beginn der Myokardkultur ein Katecholaminmangel mit konsekutiver negativer Inotropie vorlag, der jedoch für die humanen insuffizienten Myokardproben nicht alleinige Ursache des Kraftabfalls war, da dieser durch adrenerge Stimulation mittels Denopamin abzuschwächen, aber nicht zu verhindern war. Anhand eines Abbaus von SERCA2a und Phospholamban konnte als Kausalität des Kraftabfalls darüber hinaus ein sog. „myocardial stunning“ als Ischämie-Reperfusionsreaktion ohne funktionelle Schädigung des Myokards ver-mutet werden. Im weiteren Kulturverlauf zeigte sich einerseits eine Erholung der Myokardslices von diesem Zustand mit Re-Expression der abgebauten Proteine, andererseits in den mit Denopamin behandelten Präparaten auch, wie zu erwarten war, eine positive Inotropie und Verkürzung der Refraktärzeit. Für die nicht insuffizienten Pavian-Myokard-Präparate zeigten sich die Effekte im Verlauf der Kon-traktionskraft-Messung mit einer wesentlich rascheren Kinetik und insgesamt abgemildert, bevor es im weiteren Verlauf wieder zu einem langsamen Absinken der Kraft kam. Hierdurch ließ sich nachweisen, dass es sich bei den für humanes Myokard beobachteten Effekten eher nicht um reine Anpassungsreaktionen an die Kultur gehandelt hatte. Zudem ließ sich zeigen, dass ein „myocardial stunning“ in den Pavianpräparaten nicht vorlag, sodass ein Katecholaminmangel als primäre Ursache des Kraftverlaufs wahrscheinlich schien. Die Ursache für die Unterschiede im Pavianmyokard dürfte primär im nicht insuffizienten Ausgangszustand des Gewebes gelegen haben. Im Rahmen der Untersuchungen fielen als weitere interessante Effekte auch eine deutliche Abnahme der Phospholamban-Phosphorylierung an der Aminosäure Ser-16 für alle Präparate sowie eine zunehmende Positivierung der Kraft-Frequenz-Abhängigkeit der Myokardpräparate auf, die mit einer vermehrten Phosphorylierung an Thr-17 des Phospholambans einherging. Die Erforschung der Ursachen dieser Beobachtungen bietet ebenso wie die weiterführenden Untersuchungen obengenannter Effekte z.B. mittels mRNA-Transkriptionsdaten Anlass zu weiteren Studien, die mit der vorgestellten Kulturtechnik auch in größeren Dimensionen denkbar wären.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 21. November 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Dendorfer, Andreas