Development of barcoded GPCR assays to assess the effects of neuroleptics for brain disorders in living cells

Wu, Yuxin (2024): Development of barcoded GPCR assays to assess the effects of neuroleptics for brain disorders in living cells. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Background: G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the largest protein family in the human genome and are targeted by 35% of FDA-approved drugs. Their signalling pathways are complex and attractive for drug discovery. GPCR activation can be measured using the split TEV protein-protein interaction technique at the membrane. In addition, pathway reporter gene assays can be used at the transcriptional level via cis-regulatory elements, as these can be activated independently of the transducer pathways of GPCR activation. Methods: First, I identified whether the combinations of the signal peptide (SP) and the β-arrestin binding motif (i.e., C-terminal tail of the vasopressin 2 receptor (AVPR2); V2R tail) for six GPCRs and cell backgrounds of four cell types affect the β-arrestin recruitments with the split TEV GPCR assay in a transfection-based way. Then I developed a living cell-based plat-form for the multiplex profiling GPCR signalling activities at the transcriptional level, called the barcoded GPCR pathway assay. GPCRs were stably integrated into HEK293 cells to avoid the variability associated with transient transfection. To monitor the multiplex profiling of G protein-coupled receptor (GPCR) signalling activities, a lentivirus-based sensor library was used encoding various genetically encoded pathway sensors, based on cis-regulatory ele-ments. Results: The split TEV GPCR assays revealed that the combinations of SP and V2R tail have different effects depending on the GPCR, whereas HEK293 cells provided the best perfor-mance in most situations. Then I selected HEK293 cells for the barcoded GPCR pathway as-say. The robustness of the barcoded GPCR pathway assay was confirmed by testing various plate formats, MOIs (multiplicity of infection) of the lentiviral sensor library, and ligand stimula-tion. Furthermore, the reproducibility of the barcoded GPCR pathway assay was demonstrated through seven independent repetitions performed on different days. However, the combination of stable cells and the lentiviral sensor library produced two issues. Firstly, there was crosstalk between different stable cells due to barcode sequencing leakage. Secondly, the next-generation sequencing procedure can result in so-called read eating effects. This occurred because the barcodes from the index sensors, which were introduced when the stable cells were established, have much higher mRNA levels than the barcodes from the lentiviral sensor library. As a result, sequencing resources are intensively used for these frequently occurring barcodes, leaving only a limited and insufficient amount of sequencing resources for low oc-curring barcodes. Outlook: Although the above two issues need to be addressed, the success of the project is underlined by the robustness and reproducibility of the barcoded GPCR pathway assay, providing a solid foundation for its further development.

Abstract

Hintergrund: G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Proteinfamilie im menschlichen Genom und das Target von 35% der von der FDA zugelassenen Medikamente. Die Signalwege, die von GPCRs aktiviert werden, sind komplex und zugleich attraktiv für die pharmazeutische Forschung. Die Aktivierung von GPCRs kann einerseits mit der Split-TEV-Protein-Protein-Interaktionstechnik direkt an der Zellmembran gemessen werden. Darüber hinaus können Signalweg-Assays, die auf einem transkriptionellem Readout beruhen und cis-regulierende Elemente nutzen, verwendet werden, da diese Reportergen-Assays unabhängig von den aktivierten Signalwegen GPCR-Aktivitäten abbilden können. Methoden: Zunächst untersuchte ich, ob die Kombinationen des Signalpeptids (SP) und des β-Arrestin-Bindungsmotivs (d.h. C-terminaler Tail des Vasopressin-2-Rezeptors (AVPR2); V2R-Tail) für sechs GPCRs und in vier verschiedenen Zelltypen die β-Arrestin-Rekrutierung mit dem Split-TEV-GPCR-Assay auf transfektionsbasierte Weise beeinflussen. Anschließend entwickelte ich eine auf lebenden Zellen basierende Plattform für die multiparametrische Profilierung von GPCR-Signalaktivitäten auf transkriptioneller Ebene, den sogenannten Barcoded GPCR Pathway Assay. Die GPCRs wurden einzeln in HEK293-Zellen integriert, um die mit der transienten Transfektion verbundene Variabilität zu vermeiden. Um die Profilierung der Signalaktivitäten von G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) zu messen, wurde eine Lentivirus-basierte Sensorbibliothek mit verschiedenen genetischen Signalwegsensoren infiziert. Ergebnis: Die Split-TEV-GPCR-Assays zeigten, dass die Kombinationen von SP und V2R-Schwanz je nach GPCR unterschiedliche Effekte hatten, wobei HEK293-Zellen in den meisten Situationen die beste Assay-Performance zeigten. Daher wählte ich HEK293-Zellen für den Test mit dem multiparametrischen GPCR-Signalweg-Assay aus. Die Robustheit des dieses Assays wurde durch das Testen verschiedener Plattenformate, MOIs (Multiplicity of Infection) der lentiviralen Sensorbibliothek und der Stimulation mit verschiedenen Liganden bestätigt. Darüber hinaus wurde die Reproduzierbarkeit des multiparametrischen GPCR-Signalweg-Assays durch sieben unabhängige Wiederholungen an verschiedenen Tagen nachgewiesen. Die Kombination von stabilen Zellen und der lentiviralen Sensorbibliothek war jedoch mit zwei Problemen verbunden. Zum einen kam es aufgrund von Crosstalk in der Barcode-Sequenzierung zu Überlappungen zwischen verschiedenen stabilen Zellen. Zweitens kann die NGS-Sequenzierungstechnik zu sogenannten Read-Eating-Effekten führen. Diese treten auf, wenn die Barcodes der Index-Sensoren, die bei der Etablierung der stabilen Zellen eingeführt wurden, wesentlich höhere mRNA-Werte aufweisen als die Barcodes der lentiviralen Sensorbibliothek. Dies hat zur Folge, dass die Sequenzierressourcen für diese häufig vorkommenden Barcodes intensiv genutzt werden und nur eine begrenzte und unzureichende Menge an Sequenzierressourcen für die selten vorkommenden Barcodes übrig bleibt. Ausblick: Obwohl die beiden oben genannten Probleme noch gelöst werden müssen, wird der Erfolg des Projekts durch die Robustheit der Sequenzierbibliothek gewährleistet.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: GPCR, Multiplexed assay, Barcoded assay, Drug discovery, NGS
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 12. August 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Wehr, Michael