Bestimmung des Alkoholmarkers Phosphatidylethanol aus Trockenblutproben mittels LC-MS/MS zur Klassifizierung eines vorangegangenen Alkoholkonsums

Herzog, Josefine (2024): Bestimmung des Alkoholmarkers Phosphatidylethanol aus Trockenblutproben mittels LC-MS/MS zur Klassifizierung eines vorangegangenen Alkoholkonsums. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

In dieser Dissertation wurde eine Methode zur Detektion von insgesamt sieben Phos-phatidylethanol-Homologen (PEth 16:0/18:1, 16:0/18:2, 16:0/20:4, 17:0/18:1, 18:0/18:1, 18:1/18:1 und 18:0/18:2) in Trockenblutproben (DBS) mittels Hochleistungsflüssigkeitschroma-tographie-Tandemmassenspektrometrie nach den Richtlinien der Gesellschaft für Toxikologi-sche und Forensische Chemie validiert. Anschließend wurde die Methode verwendet, um bisher offene Fragestellungen bezüglich PEth, insbesondere in der Fahreignung, zu beantworten. PEth beschreibt eine Gruppe von abnormalen Phospholipiden, die nur bei Anwesenheit von Ethanol gebildet werden. Diese akkumulieren vorrangig in der Zellmembran von Erythrozyten, da hier das Enzym Phosphatidylcholin-Phospholipase (EC 3.1.3.75), welches für den Abbau von PEth verantwortlich ist, fehlt. Ein Unterschreiten von 20 ng PEth 16:0/18:1/ mL Blut wird für die Annahme einer Alkoholabstinenz, und ein Überschreiten von 210 ng PEth 16:0/18:1/ mL Blut für ein nicht-sozial verträgliches Trinkverhalten empfohlen. In der ersten Publikation wurde die erfolgreiche Validierung der Methode für die Parameter Se-lektivität, Linearität, Genauigkeit, Stabilität, Matrixeffekte, Wiederfindung, Carry-over und Grenzwerte erstmalig für sieben PEth-Homologe vorgestellt. Zudem konnte gezeigt werden, dass bei initial PEth-negativen Probanden ein exzessives Händedesinfizieren mit ethanolhalti-gen Lösungen nicht zu einer Überschreitung des Grenzwertes von 20 ng PEth 16:0/18:1/ mL Blut führte. Die zweite Publikation stellt einen einmaligen Trinkversuch mit 18 Probanden nach einem dreiwöchigen Verzicht auf alkoholhaltige Genussmittel dar. Fünf Probanden, die eine durch-schnittliche BAK von 0,93 ‰ aufwiesen, überschritten am Folgetag des Trinkversuchs den Grenzwert von 20 ng PEth 16:0/18:1/ mL Blut. Durch eine Kombination mit PEth 16:0/18:2 oder Ethylglucuronid (EtG) in DBS konnte die Sensitivität für die Detektion eines vorangegangenem Alkoholkonsums auf 72,2 % bzw. 100 % gesteigert werden. In der dritten Veröffentlichung do-kumentierten 23 Teilnehmer über sechs Monate ihren täglichen Alkoholkonsum, der oft deutli-chen Schwankungen unterlag, mittels einer Social Media App. In regelmäßigen Abständen von zwei bis vier Wochen wurde Kapillarblut für die PEth-Analytik, nach drei und sechs Monate je-weils eine 3 cm lange, proximale Haarsträhne für die EtG-Bestimmung entnommen. Während 22 von 23 Probanden PEth-positive (> 20 ng PEth 16:0/18:1/ mL Blut) Ergebnisse erzielten, konnte der Alkoholkonsum (> 5 pg EtG/ mg Haar) nur in 14 Haarproben nachgewiesen werden. Somit konnte gezeigt werden, dass Änderungen im Trinkverhalten durch PEth schneller als durch EtGH angezeigt werden. In der letzten Publikation wurde die Stabilität von zehn PEth-positiven, alko-holnegativen Realproben bei unterschiedlichen Bedingungen untersucht. Dabei erfolgte die Lagerung sowohl in Vollblut als auch in DBS bei Temperaturen von -80°C, 4°C und 18°C. Es konnte gezeigt werden, dass PEth 16:0/18:1 in 9 von 10 Proben unabhängig von der Lage-rungstemperatur sowohl in DBS als auch in Vollblut über 60 Tage stabil war. Insgesamt war PEth in DBS deutlich länger als im Vollblut stabil. Zusätzlich zu den Publikationen wurden die Ergebnisse dieser Arbeit auf nationalen und interna-tionalen Fachkonferenzen vorgestellt.

Abstract

In this doctoral thesis, a liquid chromatography/tandem mass spectrometry method to detect up to seven phosphatidylethanol homologues (PEth 16:0/18:1, 16:0/18:2, 16:0/20:4, 17:0/18:1, 18:0/18:1, 18:1/18:1 und 18:0/18:2) in dried blood spots (DBS) was validated. The validation was performed according to the guidelines of the German Society of Toxicological and Foren-sic Chemistry. Thereafter, this method was applied to further investigate some open questions concerning PEth, especially those regarding fitness-to-drive. PEth describes a group of abnormal phospholipids being formed only when ethanol is present in blood. PEth accumulates primarily in the cell membrane of erythrocytes due to the lack phosphatidylcholine-phospholipase (EC 3.1.3.75) being involved in the degradation of PEth. Concentrations of < 20 or > 210 ng PEth 16:0/18:1/ mL blood are recommended when as-sessing teetotalism or excessive alcohol consumption, respectively. The first publication describes the successful method’s validation including tests for selectivity, linearity, precision, stability, recovery, matrix effects, carry-over, and limits of detection of sev-en PEth homologues. Moreover, it has been shown, that initial PEth-negative test subjects are not endangered to surpass the lower threshold of 20 ng PEth 16:0/18:1/ mL blood by exces-sively using an ethanolic hand sanitizer. The second publication presents a single drinking event of 18 participants after a three-week abstinence of alcohol. Five subjects with a mean blood alcohol concentration of 0.93 ‰ reached more than 20 ng PEth 16:0/18:1/ mL blood on the following day. By combining both PEth 16:0/18:2 and ethyl glucuronide (EtG) in DBS, there was an increased sensitivity to detect recent alcohol consumption of 72.2 % and 100 %, re-spectively. In publication 3, 23 participants documented their daily alcohol consumption reveal-ing individual fluctuations via a social media app. Capillary blood to detect PEth was collected periodically every two to four weeks. After three and six months, a 3 cm long, proximal hair strand for the determination of EtG was collected as well. Twenty-two out of 23 participants had positive PEth results (> 20 ng PEth 16:0/18:1/ mL blood), whereas only 14 participants had EtGH concentrations of more than 5 pg/mg. In contrast to EtG in hair, PEth showed a rapid adaption in its concentration when the drinking behavior changes. In the last publication, the stability of PEth-positive, but ethanol-free samples stored under different conditions was inves-tigated. Storage was conducted both in whole blood and DBS, and samples were stored at -80°C, 4°C and 18°C. Nine of ten samples passed the stability criterion for PEth 16:0/18:1 for 60 days both in whole blood and DBS independent of the storage temperature. Altogether, the stability criterion for PEth (16:0/18:1, 16:0/18:2, 16:0/20:4, 18:0/18:1, and 18:0/18:2) was passed longer by using DBS than whole blood. The results obtained during these four publications were presented on both national and inter-national expert meetings.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 10. Juni 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Mußhoff, Frank