Herstellung eines Reportersystems und molekulare Charakterisierung von cagP - einer Komponente des Cag-Typ IV-Sekretionssystems des humanpathogenen Bakteriums Helicobacter pylori

Laue, Sonja (2024): Herstellung eines Reportersystems und molekulare Charakterisierung von cagP - einer Komponente des Cag-Typ IV-Sekretionssystems des humanpathogenen Bakteriums Helicobacter pylori. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Helicobacter pylori is a gastric bacterium that is pathogenic to humans. Around 50% of people worldwide are infected. The infection is associated with chronic gastritis, peptic ulcers and stomach cancer. Gastric cancer is the third most common cancer leading to death and can be attributed to H. pylori infection in almost all cases. In times of increasing resistance to antibiotics, the rates of treatment failures in eradication attempts rise to over 50%. The numbers vary depending on the geographic location and therapy. A precise understanding of the pathogenicity mechanism, as well as the proteins and genes involved, is essential in the search for new therapeutic approaches. The Cag type IV secretion system is a crucial pathogenicity factor. Recent research indicates that cagP has a regulatory function. It was shown that a cagP deletion results in a reduced CagA translocation and phosphorylation, a reduced IL8 induction and a reduced expression of cagH, cagI and cagL. All of these are essential components which increase the pathogenicity of the Cag type IV secretion system. The results found in literature regarding the expression of cagP are very controversial. According to some sources cagP could neither be detected as a full-length transcript, nor as a protein. In the course of this dissertation the activity of the cagP-promoter could be confirmed and an almost complete cagP transcript could be inferred using RT qPCR. This work focuses on the development of a highly sensitive NanoLuc cagP reporter system. With the aid of a shine dalgarno sequence inserted into the upstream region of cagP, the required sensitivity was achieved and the reporter system is now capable of detecting cagP expression using a fluorescence reader. Experiments with RT qPCR further revealed that the transcription of cagP is significantly reduced when incubated with AGS cells. Additionally, the interaction of cagP with cagG was examined. While it could not be clearly clarified weather cagG expression is affected by a cagP deletion, it could be confirmed that a cagP deletion leads to a reduced cagH, cagI and cagL expression as well as to a reduced CagA translocation. In order to determine the effect of external conditions on the expression of cagP, first trials with the new NanoLuc reporter were started. So far, clear evidence regarding an adjustment of the cagP expression could not be drawn from these first trials. The newly developed reporter system shows promise for future experiments due to its heightened sensitivity in detecting cagP expression. The molecular mechanism and further gene expression analysis of cagP remain subject of further research.

Abstract

Helicobacter pylori ist ein humanpathogenes Magenbakterium. Weltweit sind etwa 50% der Menschen infiziert. Die Infektion ist mit einer chronischen Gastritis, peptischen Ulzera und Magenkrebs assoziiert. Magenkrebs ist die dritthäufigste zum Tode führende Krebserkrankung und in nahezu allen Fällen auf eine H. pylori Infektion zurückzuführen. In Zeiten zunehmender Antibiotikaresistenzen steigen die Raten der Therapieversager bei Eradikationsversuchen auf über 50 %. Die Zahlen variieren je nach geografischer Lage und Therapie. Ein genaues Verständnis der Pathogenitätsmechanismen sowie der beteiligten Proteine und Gene ist auf der Suche nach neuen Therapieansätzen unabdingbar. Einen wesentlichen Pathogenitätsfaktor stellt das Cag-Typ-IV-Sekretionssystem dar. Jüngste Forschungen weisen darauf hin, dass cagP eine regulatorische Funktion zukommt. So konnte gezeigt werden, dass eine cagP Deletion in einer verminderten CagA Translokation und Phosphorylierung, einer verringerten IL8 Induktion sowie einer reduzierten Expression von cagH, cagI und cagL resultiert. Allesamt stellen essentielle pathogenitätsfördernde Mechanismen des Cag-Typ-IV-Sekretionssystems dar. Hinsichtlich der Expression von cagP lassen sich in der Literatur stark kontroverse Ergebnisse finden, wobei einigen Quellen zufolge cagP weder als vollständiges Transkript, noch als Protein detektiert werden konnte. Im Rahmen dieser Dissertation konnte die Aktivität des cagP Promotors bestätigt und auf ein nahezu vollständiges cagP Transkript mittels RT qPCR geschlossen werden. Im Vordergrund dieser Arbeit steht die Entwicklung eines hochsensitiven NanoLuc cagP Reportersystems, mit dessen Hilfe sich die cagP Expression nach Einfügen einer Shine-Dalgarno Sequenz in der Fluoreszenzmessung detektieren lässt. Mittels RT-qPCR konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass die Transkription von cagP bei einer Inkubation mit AGS Zellen signifikant reduziert wird. Es wurde außerdem eine mögliche Interaktion von cagP mit cagG überprüft. Während nicht eindeutig geklärt werden konnte, ob die cagG-Expression von einer cagP Deletion beeinträchtigt wird, konnte bestätigt werden, dass eine cagP Deletion zu einer verminderten Expression von cagH, cagI und cagL sowie zu einer reduzierten CagA Translokation führt. Um eine mögliche Induktion bzw. Reduktion durch äußere Bedingungen in der Genexpression von cagP feststellen zu können, wurden erste Versuche mit dem neuen NanoLuc Reporter gestartet. Klare Hinweise über eine Anpassung der Expression konnten im Rahmen der initialen Versuche bisher noch nicht entdeckt werden. Die Nutzung des neu entwickelten Reportersystems für weitere Experimente ist jedoch vielversprechend. Der molekulare Mechanismus sowie weitere Genexpressionsanalysen von cagP bleiben Inhalt zukünftiger Forschung.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Helicobacter pylori, cagT4SS, cagPAI, cagP, Reprotersystem
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Deutsch
• Datum der mündlichen Prüfung: 20. Juni 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Fischer, Wolfgang