Development of novel phosphatidylserine-binding reagents for research, diagnostics, and therapy

Kranich, Jan (2024): Development of novel phosphatidylserine-binding reagents for research, diagnostics, and therapy. Habilitationsschrift, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

The studies discussed here explore the multifaceted role of the phospholipid phosphatidylserine (PS) as both an “eat-me” signal for apoptotic cells and as a useful marker to study extracellular vesicles (EVs). The works summarized here leverage the newly developed PS-binding reagents derived from the secreted glycoprotein MFG-E8, which functions as a bridging molecule between apoptotic cells and macrophages. Thereby MFG-E8 facilitates the engulfment of apoptotic cells by the phagocytosing macrophage. In germinal centers MFG-E8 is solely produced by follicular dendritic cells (FDCs). By supplying MFG-E8 they license tingible body macrophages to efficiently clear dying B cells that occur during the germinal center reaction. Lack of FDC-produced MFG-E8 leads to accumulation of apoptotic cells on the surface of macrophages and impairs their degradation, ultimately promoting autoimmunity. MFG-E8 also plays a pivotal role in the brain especially during pathological conditions, such as prion disease. Its absence leads to accumulation of dying cells and of infectious prions accelerating disease progression. Detecting and studying dying cells in tissues presents challenges, due to their scarcity and due to the lack of suitable reagents. However, the development of novel fluorescent MFG-E8 fusion proteins for in vivo PS labeling allowed the identification of PS+ cells in their native microenvironment. Combined with cell analysis using imaging flow cytometry and deep-learning assisted image interpretation, this approach facilitates the precise detection and characterization of dying cells based on PS exposure. Surprisingly, it also revealed that only few PS+ cells are apoptotic. Unexpectedly, most PS+ cells were living cells decorated with PS+ extracellular vesicles (EVs) on their surface. In vivo PS-labeling using fluorescent MFG-E8-based reagents has unlocked the possibility to investigate interactions of EVs with lymphocytes. During viral infections, such as lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) in mice and SARS-CoV-2 in humans, T- cells and particularly activated cytotoxic T cells displayed a pronounced increase in EV-binding. Notably, in SARS-CoV-2 infections, EV-binding by peripheral blood mononucleated cells (PBMCs) strongly correlates with disease severity and was highest in patients with severe disease. T-cells decorated with PS+ platelet-derived microparticles show increased proliferation and a higher expression of effector cytokines. In LCMV-infected mice, activated T cells bind exosomal EVs originating from antigen-presenting cells. These EVs trigger antigen-dependent stimulation in pre-activated T-cells and cause clustering of the T-cell receptor complex, activation of the transcription factor NFAT, drive T cell proliferation and enhance expression of effector genes. Collectively, these results underscore the importance of EVs in modulating T-cell responses making them an interesting therapeutic target for improving or inhibiting T -cell responses in viral infections, cancer, or autoimmunity.

Abstract

Die hier besprochenen Studien untersuchen die vielseitige Rolle des Phospholipids Phosphatidylserin (PS), das sowohl als "Eat me"-Signal für apoptotische Zellen, als auch als wertvoller Marker zur Untersuchung extrazellulärer Vesikel (EVs) fungiert. Die hier präsentierten Arbeiten nutzen neu entwickelte PS-bindende Reagenzien, die von dem sezernierten Glykoprotein MFG-E8 abgeleitet sind. MFG-E8 agiert als Brückenmolekül zwischen apoptotischen Zellen und Makrophagen, wodurch die Phagozytose von apoptotischen Zellen durch Makrophagen erleichtert wird. Im Keimzentrum wird MFG-E8 ausschließlich von follikulären dendritischen Zellen (FDCs) produziert. Durch die Produktion von MFG-E8 ermöglichen sie den Tingible-Body-Makrophagen die effiziente Beseitigung absterbender B-Zellen, die während der Keimzentrumsreaktion auftreten. Ein Fehlen von FDC-produziertem MFG-E8 führt zur Akkumulation apoptotischer Zellen auf der Oberfläche der Makrophagen und beeinträchtigt deren Abbau, was letztlich die Entstehung von Autoimmunerkrankungen begünstigt. MFG-E8 spielt auch im Gehirn eine bedeutende Rolle, insbesondere bei pathologischen Zuständen wie Prionenerkrankungen. Im Mausmodell führt ein Mangel an MFG-E8 zu einer Akkumulierung absterbender Zellen und infektiöser Prionen, was den Krankheitsverlauf beschleunigt. Die Detektion und die Untersuchung sterbender Zellen in Geweben sind aufgrund ihrer Seltenheit und des Mangels an geeigneten Reagenzien eine Herausforderung. Die Entwicklung neuer fluoreszierender MFG-E8-Fusionsproteine für die In-vivo-PS-Markierung ermöglicht die Identifizierung von PS+-Zellen in ihrer natürlichen Umgebung. In Kombination mit Zellanalyseverfahren wie Imaging Durchflusszytometrie und Deep-Learning-gestützter Bildinterpretation wird die präzise Detektion und Charakterisierung sterbender Zellen auf Grundlage der PS-Exposition erleichtert. Überraschenderweise ergab sich, dass die Mehrheit der PS+-Zellen nicht apoptotisch sind, sondern lebende Zellen, die PS+ extrazelluläre Vesikel (EVs) auf ihrer Oberfläche tragen. Die In-vivo-PS-Markierung mit fluoreszierenden Reagenzien auf MFG-E8-Basis hat die Möglichkeit eröffnet, die Interaktionen von EVs mit Lymphozyten zu untersuchen. Während Virusinfektionen, wie dem lymphozytären Choriomeningitis-Virus (LCMV) bei Mäusen und SARS-CoV-2 beim Menschen zeigen T-Zellen, insbesondere aktivierte zytotoxische T-Zellen, eine ausgeprägte Zunahme der EV-Bindung. Bei SARS-CoV-2-Infektionen korrelierte die EV-Bindung durch mononukleäre Zellen im peripheren Blut (PBMCs) stark mit dem Schweregrad der Erkrankung und war bei Patienten mit schwerem Verlauf am höchsten. T-Zellen, die mit PS+-Mikropartikeln von Blutplättchen dekoriert waren, zeigten eine erhöhte Proliferation und eine stärkere Expression von Effektorzytokinen. In LCMV-infizierten Mäusen binden aktivierte T-Zellen exosomale EVs, die von Antigen-präsentierenden Zellen stammen. Diese EVs lösen eine antigenabhängige Stimulation in voraktivierten T-Zellen aus, was zu einer Clusterbildung des T-Zell-Rezeptorkomplexes, zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFAT, zur Förderung der T-Zellproliferation und zur Steigerung der Expression von Effektorgenen führt. Zusammengenommen unterstreichen diese Erkenntnisse die bedeutende Rolle von EVs bei der Modulation von T-Zell-Antworten und machen sie zu einem vielversprechenden therapeutischen Ziel für die Verbesserung oder Inhibition von T-Zell-Antworten bei akuten oder chronischen Virusinfektionen, Krebserkrankungen oder Autoimmunität.

• Dokumententyp: Habilitationsschriften
• Keywords: MFG-E8, Lactadherin, Phosphatidylserine, Apoptosis, Extracellular Vesicles
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 2024