Loss-of-function mechanisms linked to HTRA1 Mac-domain mutations causing cerebral small vessel disease

Gernert, Jonathan A. (2024): Loss-of-function mechanisms linked to HTRA1 Mac-domain mutations causing cerebral small vessel disease. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Introduction. Mono- and biallelic mutations in the gene encoding the secreted serine protease high temperature requirement protein A1 (HTRA1) cause familial cerebral small vessel disease (CSVD) manifesting with ischemic stroke and dementia. Archetypal disease-causing mutations include nonsense and missense mutations that target the protease-domain of HTRA1 and impair its function. A set of missense mutations targeting the aminoterminal Mac-domain of HTRA1 have recently been identified in CSVD cases. The function of this domain has not been elucidated and the disease-related Mac-domain mutations leave HTRA1 proteolytically active in vitro. Aims. The objectives of the present work were to examine the phenotype of CSVD cases carrying HTRA1 Mac-domain mutations and to study the consequences of these mutations on key molecular and cellular aspects of HTRA1 function. Results. Based on a literature review, I determined that the phenotype of the seven reported Mac-domain mutation carriers recapitulates that of archetypal mutations carriers, although there is a trend towards a lower prevalence of stroke and non-neurological symptoms. Of interest, disease-related mutations are clustered in the Kazal-region of the Mac-domain. Biochemical analysis of HTRA1 protein stability in human cells transfected to overexpress recombinant HTRA1 indicated that one of the Mac-domain mutants (S121R) is rapidly degraded compared to control HTRA1. Moreover, analysis of purified proteins revealed that the conformation of this mutant is distinct from that of control HTRA1, thus suggesting partial misfolding of HTRA1-S121R. Protease activity measurements towards analytical as well as physiological substrates further demonstrated that the enzymatic activity of the Mac-domain mutants is comparable to that of HTRA1 wild-type. Exploring the interaction of HTRA1 with the extracellular matrix (ECM), I determined that the Mac-domain is involved in the insertion of HTRA1 in the ECM and identified vitronectin and fibronectin as putative ECM partners of HTRA1. However, I found that the ECM deposition of the Mac-domain mutants is comparable to that of control HTRA1. Conclusion. Collectively, my work provides novel insights in the pathogenesis of HTRA1-related CSVD.

Abstract

Einleitung. Mono- und biallelische Mutationen im Gen der sekretierten Serin Protease HTRA1 (high temperature requirement protein A1) verursachen eine familiär cerebrale Mikroangiopathie (CSVD), die sich mit ischämischen Schlaganfällen und Demenz manifestiert. Archetypische krankheitsverursachende HTRA1 Mutationen beinhalten Nonsense- und Missense-Mutationen, die auf die Protease-Domäne abzielen und ihre Funktion beeinträchtigen. Kürzlich wurde eine Reihe an Missense-Mutationen in CSVD-Fällen identifiziert, welche auf die aminoterminale Mac-Domäne abzielen. Die Funktion(en) dieser Domäne wurden bisher nicht geklärt und die krankheitsassoziierten Mac-Domäne Mutationen lassen HTRA1 in vitro proteolytisch aktiv. Ziel. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Phänotyp von CSVD-Fällen mit HTRA1 Mac-Domäne Mutationen und die Auswirkungen dieser Mutationen auf wichtige molekulare und zelluläre Aspekte der HTRA1-Funktion zu untersuchen. Ergebnisse. Basierend auf einer Literaturübersicht stellte ich fest, dass der Phänotyp der sieben beschriebenen Mac-Domäne Mutationsträger den der archetypischen Mutationsträger widerspiegelt, wobei es einen Trend zu einer niedrigeren Prävalenz von Schlaganfällen und nicht-neurologischen Manifestationen gibt. Krankheitsassoziierte Mutationen gruppieren sich zudem in der Kazal-Region der Mac-Domäne. Biochemische Analysen der HTRA1 Protein Stabilität in humanen Zellen, transfiziert zur Überexpression von rekombinantem HTRA1, zeigten, dass eine Mac-Domäne Mutante (S121R) im Vergleich zum Kontroll-HTRA1 rasch abgebaut wird. Entsprechend ergab die Untersuchung aufgereinigter Proteine, dass sich die Konformation dieser Mutante von der des Kontroll-HTRA1 unterscheidet, was auf eine teilweise Fehlfaltung von HTRA1-S121R hinweist. Die Untersuchung der Protease Aktivität gegenüber analytischen und physiologischen Substraten demonstrierte, dass die enzymatische Aktivität von Mac-Domäne Mutanten vergleichbar mit dem HTRA1 Wildtyp ist. Schließlich untersuchte ich die Wechselwirkung von HTRA1 mit der extrazellulären Matrix (ECM): Ich stellte fest, dass die Mac-Domäne an der Insertion von HTRA1 in die ECM beteiligt ist und identifizierte Vitronectin und Fibronectin als mutmaßliche ECM-Partner von HTRA1. Die Ablagerung in der ECM der HTRA1 Mac-Domänen Mutanten scheint jedoch mit der von Kontroll-HTRA1 vergleichbar zu sein. Fazit. Zusammenfassend liefert die Arbeit neue Einblicke in die Pathogenese der HTRA1-assoziierten CSVD.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: Cerebral small vessel disease; HTRA1; CARASIL
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 7. März 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Dichgans, Martin