Mass spectrometry-based exploration of novel interactors in ubiquitin-mediated processes

Siebert, Alexander (2024): Mass spectrometry-based exploration of novel interactors in ubiquitin-mediated processes. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Die Proteinhomöostase ist eine entscheidende Komponente der zellulären Integrität, die durch interne und umweltbedingte Stressfaktoren aus dem Gleichgewicht geraten kann. Um dem entgegenzuwirken, haben Zellen mehrere Systeme für die Faltung, Regulation und den Abbau von Proteinen entwickelt. Proteine müssen zunächst de novo synthetisiert werden und in ihre native Form gebracht werden, damit sie die gewünschte Funktion erfüllen können. Die Faltung von Proteinen ist ein komplexer Prozess, der die Hilfe von molekularen Chaperonen wie HSP90 (Hitzeschockprotein HSP 90-beta) erfordert, die neu synthetisierten oder fehlgefalteten Proteinen dabei helfen ihre native Form einzunehmen und sie vor Aggregation bewahren. Krankheitsmutationen oder zelluläre Stressfaktoren können dazu führen, dass Proteine geschädigt werden oder verklumpen und somit abgebaut werden müssen. Die zwei wichtigsten Abbauwege in der Zelle, sind das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) und die Autophagie. Das UPS ist dafür verantwortlich, einzelne Proteine dem proteasomalen Abbau zuzuführen. Hierfür werden einzelne Lysine des Substrats mit Ubiquitin modifiziert. Dies erfordert ein komplexes Konjugationssystem, das aus einem E1-Ubiquitin-aktivierenden, einem E2-Ubiquitin-konjugierenden Enzym und einer E3-Ubiquitin-Ligase besteht. E3-Ligasen können hierbei allein oder als Teil größerer Komplexe wie z.B. dem modularen Cullin-Ring-Ligase (CRL) Komplex arbeiten. Eine spezielle CRL ist der SCFCyclin-F-Komplex, der aus Cullin1, RBX1, SKP1 und dem F-Box-Protein Cyclin F besteht, letzteres bestimmt die Substratspezifität. Anders als es sein Name vermuten lässt, bindet Cyclin F nicht an eine Cyclin-abhängige Kinasen. Stattdessen ubiquitiniert es eine Vielzahl von zellzyklusspezifischen Zielproteinen und Proteine, die an der Beseitigung von DNS-Schäden beteiligt sind. Mittlerweile wurden zahlreiche Zielproteine für Cyclin F beschrieben, wovon die meisten jedoch in sich teilenden Zelltypen untersucht wurden, wohingegen es nur wenig Informationen über die Funktion von Cyclin F in neuronalen oder Neuron-ähnlichen Zelllinien gibt, die nach der Differenzierung keine Mitose mehr durchlaufen. Außerdem wurden in den letzten Jahren Cyclin-F-Mutationen mit der Entstehung von Amyotropher Lateralsklerose (ALS) in Verbindung gebracht. Autophagie, der zweite wichtige Abbaumechanismus in der Zelle, umfasst zwei Wirkmechanismen: die selektive und die nicht-selektive Autophagie. Bei der Autophagie wird Cargo von einer wachsenden Doppelmembran, dem Phagophor umgeben und erweitert bis sich ein Vesikel gebildet hat. Diese Struktur, Autophagosom genannt, fusioniert mit dem Lysosom und führt zum Abbau und Recycling des Cargos. Während die nicht-selektive Autophagie bei Nährstoffmangel wichtig ist, ist die selektive Autophagie ein spezialisierter Prozess, der Strukturen wie Proteinaggregate und beschädigte Organellen, unter anderem Lysosomen, abbaut. Lysosomen sind Zentren der zellulären Homöostase und am Umsatz zellulärer Komponenten beteiligt, weshalb sie in ihrem Luminalraum verschiedene Arten von Degradationsproteinen wie Hydrolasen und Nukleasen beinhalten. Eine Beschädigung dieser Organellen führt dazu, dass luminale Proteine in die Umgebung entweichen, wo sie der Zelle schaden können. Um dies zu verhindern, haben Zellen mehrere Anpassungsstrategien entwickelt, die darauf abzielen, Lysosomen zu reparieren. Bleiben diese Versuche erfolglos, wird deren Abbau eingeleitet. Der selektive Abbau von Lysosomen, auch Lysophagie genannt, wird durch die Bindung von Galektinen an β-Galaktoside initiiert und führt zu einer umfassenden Ubiquitinierung von lysosomalen Proteinen durch Ubiquitin E3-Ligasen. Diese Ubiquitinierung führt zur Rekrutierung der Autophagie-Rezeptoren p62/ SQSTM1 (Sequestosom 1) und TAX1BP1 (Tax1-bindendes Protein 1), die das beschädigte Lysosom an das LC3-besetzte Phagophor binden und weitere Komponenten der Autophagie-Maschinerie rekrutieren. Ein weiterer wichtiger Faktor für die Lysophagie ist die Ubiquitin-gesteuerte AAA-ATPase VCP, die ubiquitinierte Komponenten aus dem beschädigten Lysosom extrahiert, um den Lysophagieprozess zu unterstützen. Das Ziel meiner Arbeit war es, mit Hilfe massenspektrometrischer Methoden neue Interaktionspartner für zwei wichtige Ubiquitin-vermittelte Prozesse zu identifizieren und zu validieren, sowie die Rolle von Cyclin F in ALS-Modellen zu untersuchen. Im ersten Teil meiner Arbeit wollte ich neue Zielproteine von Cyclin F in sich nicht teilenden Zellen finden. Zu diesem Zweck habe ich mit Hilfe der CRISPR-CAS9-Technologie CCNF Knockout (KO)-Linien in der murinen Neuroblastomlinie N2a und der humanen Neuroblastomlinie SH-SY5Y erzeugt. Diese KO-Zellen habe ich zusammen mit lymphoblastoiden Zelllinien aus ALS-Patienten mit zwei unbekannten CCNF-Mutationen verwendet, um umfangreiche massenspektrometrische Analysen durchzuführen. Die Daten, die dabei ermittelt wurden, umfassen die APEX2-induzierte Nahbereichsmarkierung (close proximity proteomics), sowie Immunpräzipitationen die zur Untersuchung möglicher Interaktionspartner verwendet werden. Darüber hinaus wurde eine massenspektrometrische Analyse zur Evaluierung des Ubiquitoms, die sogenannte diGly-Ubiquitomics, eingesetzt. Dadurch war es möglich, einen Einblick in das Cyclin-F-abhängige Ubiquitom zu erhalten. Insgesamt konnte ich eine umfangreiche Datenbank für potenzielle Interaktoren und Substrate von Cyclin F erstellen. Außerdem konnte ich die Bindung von Cyclin F an das Chaperon HSP90AB1 sowie an zwei seiner Ko-Chaperone, STIP1 (stress-induced-phosphoprotein) und DNAJC7 (DnaJ homolog subfamily C member 7) bestätigen. Zusätzlich habe ich die Fähigkeit von Cyclin F zur Ubiquitinierung von HSP90AB1 mit Immunpräzipitationsansätzen, unter denaturierenden Bedingungen sowie mit spezialisierten Tandem-Ubiquitin-Bindungseinheiten (TUBE) untersucht. TUBE bindet promiskuitiv an verschiedene Ubiquitin Spezies und kann somit genutzt werden, um den Ubiquitin Status eines Proteins zu ermitteln. Mit Hilfe dieser Ansätze konnte ich zeigen, dass HSP90AB1 durch Cyclin F ubiquitiniert wird. Des Weiteren konnte ich auch den Einfluss dieser Modifikationen auf die Bindung von HSP90 mit seinen Ko-Chaperonen nachweisen. Schließlich habe ich auch Veränderungen bei der Interaktion zwischen HSP90AB1 und einigen seiner Maturierungsklienten in Abhängigkeit von Cyclin F beobachtet. Im zweiten Teil meiner Arbeit habe ich zusammen mit unseren Kooperationspartnern die Funktion der Ubiquitinierung nach Schädigung der lysosomalen Membran mit L-Leucyl-L-Leucin-Methylester (LLOME) und die Rolle von Ubiquitin beim Abbau von Lysosomen untersucht. Die Veränderung des Ubiquitoms zu verschiedenen Messzeitpunkten nach lysosomalen Schäden ermöglichte uns einen differenzierten Blick auf Lysophagy und deckte neue Faktoren auf, die an diesen Abbauweg beteiligt sind. Zu den stark modifizierten Proteinen, die hier identifiziert wurden, gehören das Aktin-stabilisierende Protein Calponin 2 (CNN2) und die Proteine des Arp2/3-Komplexes. Für beide wurde nachgewiesen, dass sie zu geschädigten Lysosomen translozieren. Hier erleichtern sie die Bildung von Phagophoren durch die Modulation der Aktinfilamentdynamik. Darüber hinaus wird CNN2 ubiquitiniert, um die rechtzeitige Entfernung aus dem Lysosom zu gewährleisten, und ist für die Rekrutierung und Lipidierung von LC3b notwendig, die es direkt mit dem Lysophagieprozess in Verbindung bringt. Um die Dynamiken des Proteins CNN2 genauer zu untersuchen, habe ich mit Hilfe der Askorbat-Peroxidase APEX2, welche an CNN2 fusioniert wurde, in LLOMe- und kontrollbehandelten Zellen close proximity proteomics durchgeführt und quantitativ verglichen. Dies ermöglichte die Identifizierung von HSPB1 als direktem Interaktor von CNN2. HSPB1 wurde bereits mit Autophagie und dem Aktinfilament-System in Verbindung gebracht und war daher ein vielversprechender Kandidat für weitere Untersuchungen. Interessanterweise zeigte die Depletion von HSPB1 ähnliche Auswirkungen wie die Depletion von CNN2, indem sie die LC3b-Rekrutierung negativ beeinflusste. Die Ähnlichkeit des Phänotyps, der bei inaktivem VCP im Vergleich zum Verlust von HSPB1 oder CNN2 beobachtet wurde, deutete auf einen Zusammenhang zwischen diesen Proteinen hin. Weitere Experimente zeigten, dass VCP CNN2 aus lysosomalen Membranen extrahiert und das ubiquitinierte Aktin-stabilisierende Protein anschließend abgebaut wird. Die Aktin-unabhängige Rekrutierung von CNN2 zum Lysosom warf jedoch die Frage auf, welche Proteine mit CNN2 assoziiert waren, bevor es durch VCP entfernt wurde. Zu diesem Zweck wiederholte ich die Untersuchung der geschädigten Lysosomen durch close proximity proteomics mit CNN2-APEX2. Um die Entfernung von CNN2 zu unterbrechen, wurden die Zellen mit NMS-873, einem VCP-Inhibitor, behandelt. Die Proteine, die in dieser Situation signifikant erhöht waren, waren p62 und VCP, die beide mit beschädigten Lysosomen kolokalisieren. Die Depletion von p62 führt auch zu einer Verringerung der CNN2-Rekrutierung. Schließlich konnten wir auch zeigen, dass sowohl HSPB1 als auch VCP für die Entfernung von ubiquitiniertem CNN2 aus beschädigten Lysosomen entscheidend sind, um Lysophagie zu ermöglichen. Zusammenfassend konnte ich einen tieferen Einblick in Ubiquitin-vermittelte Prozesse wie die Lysophagie und das UPS-System geben. Durch den unbefangenen Einsatz massenspektrometrischer Methoden habe ich neue potenzielle Interaktoren von Cyclin F und CNN2 aufgedeckt, die zu einem besseren Verständnis der jeweiligen Prozesse führen. Darüber hinaus unterstreichen diese Ergebnisse die Bedeutung von Hitzeschockproteinen für die Proteinhomöostase in beiden wichtigen Abbauprozessen.

Abstract

Protein homeostasis is a crucial component of cellular integrity that internal and environmental stressors can disturb. Cells have adapted several systems for protein folding, regulation, and degradation to counteract this. Initially, proteins have to be synthesized de novo and adopt their native form before fulfilling their desired function. The folding of proteins is a complex process that requires the participation of molecular chaperones such as HSP90 (heat shock protein 90), which assist newly synthesized or misfolded proteins in reaching their native state and preventing them from aggregation. Cellular stressors or disease mutations can lead to damaged proteins or aggregation, both of which require adequate degradation. Two of the major degradation pathways in the cell are the ubiquitin-proteasome-system (UPS) and autophagy. The UPS is responsible for targeting single proteins for proteasomal degradation by modifying substrate lysines with ubiquitin. This requires a sophisticated conjugation system consisting of an E1-ubiquitin-activating, an E2-ubiquitin-conjugating enzyme, and an E3-ubiquitin ligase. E3-ligases can work alone or as part of larger complexes such as the modular Cullin-Ring-Ligase (CRL) complex. One particular CRL is the SCF cyclin F complex consisting of Cullin1, RBX1, SKP1, and the F-Box protein cyclin F which determines substrate specificity. Contrary to the function implied by its name, cyclin F does not bind cyclin-dependent kinases. Instead, it ubiquitinates a variety of cell cycle-specific proteins as well as proteins involved in the DNA damage response. By now several targets of cyclin F were described, however, most of them were examined in cell systems that regularly undergo mitosis and little is known about cyclin F’s function in neuronal or neuron-like cell types. Moreover, in recent years cyclin F mutations were implicated in the development of ALS. Autophagy, the second important degradative pathway, includes two modes of action: selective and bulk autophagy. During autophagy cargo is engulfed by a growing double membrane, the so-called phagophore, which is elongated to form a vesicle. This structure is the autophagosome that subsequently fuses with a lysosome resulting in the degradation and recycling of cargo components. While bulk autophagy is important during nutrient starvation, selective autophagy is a specialized process in which autophagy receptors recognize structures such as aggregates and damaged organelles, including lysosomes. Lysosomes are hubs for cellular homeostasis and are involved in the turnover of cellular components and therefore harbor various types of degradative proteins such as hydrolases and nucleases in their luminal space. Damage to these organelles results in the leakage of luminal proteins into the surrounding, where they can harm the cell. To prevent this, cells have adapted several response pathways aiming to fix lysosomes. However, if these attempts remain unsuccessful, degradation is triggered. Lysophagy is initiated by the binding of galectins to β-galactosides and the extensive ubiquitination of lysosomal proteins by recruited E3-ligases. This ubiquitination leads to the recruitment of the autophagy receptors p62/SQSTM1 (sequestosome 1) and TAX1BP1 (Tax1-binding protein 1), that link the damaged lysosome to the LC3-decorated phagophore and recruit further components of the autophagy machinery. Another substantial factor for lysophagy is the ubiquitin-directed AAA-ATPase VCP that extracts ubiquitinated factors from the lysosome and the forming phagophore to assist in the lysophagic process. My thesis aimed to identify and validate interaction partners in two important ubiquitin-mediated processes using mass spectrometry as well as assess cyclin F’s influence in models of ALS. In the first part of my thesis, I aimed to find new targets of cyclin F in non-dividing cells. To this end, I generated CCNF knockouts (KO) in the murine Neuro 2a (N2a) and the human SH-SY5Y neuroblastoma cell line using CRISPR-Cas9 which results in the loss of cyclin F. Together with ALS-patient derived lymphoblastoid cell lines of two unreported CCNF mutations, I utilized these KO-cells to perform extensive mass spectrometry. The data I obtained included close proximity and immunoprecipitation approaches that were used to assess direct binding. Furthermore, diGly-ubiquitomics was utilized to get a glimpse into the cyclin F-dependent ubiquitome. With these experiments, I was able to provide a rich database for potential interactors and substrates of cyclin F. Based on the analysis I identified HSP90 (heat shock protein HSP 90-beta) as a prominent elevated factor and was able to confirm its binding to cyclin F. Additionally, I could provide evidence for the binding of cyclin F to HSP90’s co-chaperones, STIP1 (stress-induced-phosphoprotein) and DNAJC7 (DnaJ homolog subfamily C member 7). Next, I assessed cyclin F’s ability to ubiquitinate HSP90AB1 with immunoprecipitation approaches under denaturing conditions as well as with specialized tandem ubiquitin-binding entities that promiscuously bind ubiquitin. Apart from showing cyclin F-dependent HSP90AB1 ubiquitination, I could provide evidence that these modifications influence HSP90 co-chaperone binding. Further, I observed alterations in the binding of HSP90 to its maturation clients upon cyclin F knockout. Together with our collaborators, the second part of my thesis examined the role of ubiquitination upon lysosomal membrane damage using L-Leucyl-L-Leucine methyl ester (LLOME) and the role of ubiquitin in lysosomal degradation. Changes in the ubiquitome due to lysosomal damage at different time points allowed a differentiated look at lysophagy thereby highlighting new factors involved in this degradative pathway. Among the strongly modified proteins, the actin stabilizing protein calponin 2 (CNN2) and the Arp2/3 complex proteins were identified and shown to translocate to damaged lysosomes. Here, they facilitate phagophore formation by modulating actin filament dynamics. Further, CNN2 is ubiquitinated for timely removal from the lysosome and is necessary for the recruitment and lipidation of LC3b to associate it directly with the lysophagic process. To assess the dynamics of CNN2 in more detail I performed close-proximity proteomics with the help of the ascorbate peroxidase APEX2 fused to CNN2 in LLOMe versus control-treated cells, followed by a quantitative analysis. This enabled the identification of HSPB1 as a direct interactor of CNN2. HSPB1 is associated with autophagy and the actin filament system and was therefore a promising candidate for additional examination. Interestingly, HSPB1 depletion showed similar effects to CNN2 depletion by negatively affecting LC3b recruitment. The resemblance of the phenotype seen with inactive VCP compared to HSPB1 or CNN2 loss hinted towards a connection between these proteins. Additional experiments revealed the extraction of CNN2 from lysosomal membranes by VCP and the subsequent degradation of the ubiquitinated actin-stabilizing protein. The actin-independent recruitment of CNN2 to the lysosome, however, posed the question of which proteins were associated with CNN2 before removal by VCP. To this end, I repeated the examination of damaged lysosomes by close proximity proteomics with CNN2-APEX2. To pause the removal of CNN2, the cells were treated with NMS-873, a VCP inhibitor. The proteins that were significantly increased in this setting were p62 and VCP, both of which colocalize on damaged lysosomes. Interestingly, p62 depletion also leads to the reduction of CNN2 recruitment. Finally, we could also demonstrate that HSPB1, as well as VCP, are crucial for the removal of ubiquitinated CNN2 from damaged lysosomes to facilitate lysophagy. In summary, I was able to provide a deeper insight into ubiquitin-mediated processes such as lysophagy and the UPS system. By using mass spectrometry, I unveiled potential new interactors of cyclin F and CNN2 leading to a better understanding of the respective function. Also, these results iterate on the importance of heat shock proteins in protein homeostasis in both major degradative pathways.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 4. März 2024
• 1. Bericht­erstatter:in: Behrends, Christian