MFG-E8 - an antigen carrier to follicular dendritic cells

Hilgendorff, Henning Thomas (2023): MFG-E8 - an antigen carrier to follicular dendritic cells. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Previous studies establish that extracellular vesicles (EV) pulsed with antigen induce a specific humoral immune response, resulting in protective immunity. Our laboratory has created a fusion protein composed of MFG-E8 and the green fluorescent marker eGFP (MFG-E8-eGFP). It attaches to the membrane of extracellular vesicles based on MFG-E8´s property binding to phosphatidylserine (PS). Injecting the fusion protein induces quicker immune responses to eGFP than eGFP alone. This finding is comparable to studies, where EVs pulsed with antigen generate a specific humoral response in vivo. Injected MFG-E8-eGFP quickly accumulate in and around the germinal centres (GCs), while eGFP injected alone does not. Based on these results, we propose MFG-E8 as a carrier of antigen to follicular dendritic cells. We research whether this principle may apply to viral antigens, which hardly produce neutralising antibodies (nAbs) during infection. The lymphocytic choroid meningitis virus (LCMV) is widely used for immunosuppression and T-cell exhaustion research. Its GP1 is the primary protein for viral binding to the host cell and viral neutralisation. We fused the GP1 of the chronic LCMV variant Clone 13 to MFG-E8 (MFG-E8-260L-GP1). Second, we cloned the GP1 of the Armstrong LMCV (176N) similarly (MFG-E8-176N-GP1), an acute strain causing readily cleared infections within days. Third, we fused MFG-E8 to the nucleoprotein (NP) of LCMV (MFG-E8-NP). The NP produces a more rapid humoral response than GP1. We purified the fusion protein MFG-E8-176N-GP1 from stably transfected HEK cells via high-affinity FLAG chromatography. Then we injected it into mice naïve to LCMV to evaluate the production of anti-GP1 nAbs. In a neutralisation assay, we demonstrated that the serum from MFG-E8-176N-GP1 injected mice induced lower plaque-forming units than the control MFG-E8-eGFP. Moreover, MFG-E8-176N-GP1 caused lower PFU than the well-established GP1 nAb, KL-25. As a result, we concluded the presence of GP1 nAbs in the serum of MFG-E8-176N-GP1 injected mice. Consequently, it would be interesting to see if this principle applies to the other two fusion proteins, predominantly to MFG-E8-260L-GP1. It could give hints towards a new vaccine approach for immunosuppressive viruses.

Abstract

Frühere Studien zeigen, dass mit Antigen gepulste extrazelluläre Vesikel (EV) eine spezifische humorale Immunantworten auslösen und somit zu einer schützenden Immunität führen. Unser Labor hat ein Fusionsprotein kreiert, das aus MFG-E8 und dem grün fluoreszierenden Marker eGFP (MFG-E8-eGFP) besteht. Es heftet sich an die Membran von EVs aufgrund der Eigenschaft von MFG-E8 an Phosphatidylserin (PS) zu binden. Die Injektion des Fusionsproteins löst eine schnellere Immunreaktion gegen eGFP aus als eGFP allein. Dieses Ergebnis ist vergleichbar mit Studien, in denen mit Antigen gepulste EVs in vitro eine spezifische humorale Reaktion in vivo auslösen. Injiziertes MFG-E8-eGFP reichert sich schnell in und um die Keimzentren an, während allein injiziertes eGFP dies nicht tut. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse haben wir MFG-E8 als Antigenträger zu follikuläre dendritische Zellen vorgeschlagen. Wir wollten untersuchen, ob dieses Prinzip auch für virale Antigene gilt, die bei einer Infektion kaum neutralisierende Antikörper (nAk) bilden. Das lymphozytären Choriomeningitis Virus (LCMV) wird häufig zur Erforschung von Immunsuppression und T-Zell Erschöpfung eingesetzt. Sein GP1 ist das wichtigste Protein für die Bindung des Virus an die Wirtszelle und die Neutralisierung des Virus. Wir fusionierten das GP1 der chronischen LCMV-Variante Klon 13 mit MFG-E8 (MFG-E8-260L-GP1). In ähnlicher Weise klonierten wir das GP1 des Armstrong LMCV (MFG-E8-176N-GP1), eines akuten Stammes, dessen Infektion innerhalb weniger Tage ausheilt. Als drittes protein fusionierten wir MFG-E8 mit dem Nukleoprotein (NP) von LCMV (MFG-E8-NP). Das NP erzeugt eine schnellere humorale Reaktion als GP1. Wir reinigten MFG-E8-176N-GP1 aus stabil transfizierten HEK-Zellen mittels hochaffiner FLAG-Chromatographie auf. Wir injizierten es in Mäusen, um die Produktion von GP1 nAk zu untersuchen. In einem Neutralisationstest konnten wir nachweisen, dass das Serum von Mäusen, denen MFG-E8-176N-GP1 injiziert worden war, weniger Plaque-bildende Einheiten (PFU) bildete als das Kontrollserum von MFG-E8-eGFP injizierten Mäusen. Es zeigte zudem weniger PFU als der bekannte GP1-nAk, KL-25. Daraus schlossen wir auf das Vorhandensein von anti-GP1 nAk im Serum von MFG-E8-176N-GP1 injizierten Mäusen. Folgend wäre es interessant zu sehen, ob dieses Prinzip auch für die beiden anderen Fusionsproteine gilt, vor allem für MFG-E8-260L-GP1. Dieses könnte Hinweise auf einen neuen Impfstoffansatz für immunsuppressive Viren liefern.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 23. November 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Brocker, Thomas