Discovery and validation of essential modules of T cell migration into the central nervous system in a genome-wide CRISPR/Cas9 screening in experimental autoimmune encephalomyelitis

Lämmle, Katrin Franziska (2023): Discovery and validation of essential modules of T cell migration into the central nervous system in a genome-wide CRISPR/Cas9 screening in experimental autoimmune encephalomyelitis. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune, neuroinflammatory disease where peripheral immune cells infiltrate the central nervous system (CNS), causing inflammation and subsequent demyelination that ultimately leads to neuronal degeneration. The pathogenesis of MS is thought to be primarily driven by autoreactive T cells, which are the first immune cells to migrate into the CNS. Although efforts to restrict T cell migration into the CNS have yielded some success in treating MS, the need for additional treatment options remains. With this in mind, this study aimed to identify crucial genes necessary for T cell migration in the CNS in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), an animal model for MS. In this work we used an adoptive T-cell transfer EAE model in Lewis rats to conduct an in vivo genome-wide loss-of-function CRISPR/Cas9 screening in encephalitogenic T cells. Through a subsequent validation screening, a diverse set of molecules essential for T cell migration during the initial phase of EAE pathogenesis was identified. To gain comprehensive insights into the functional role of these identified candidates in regulating T cell migration, we performed validation experiments involving the generation of single knockout TMBP cells and elucidated their underlying mechanisms. This systematic approach facilitated the clustering of these genes into functionally coherent modules with significant implications for understanding T cell migration regulation. The adhesion module comprises of the α4-integrin, its binding partner β1-integrin and the integrin chaperone Hsp90b1. Loss of those genes leads to impaired attachment of T cells to vascular endothelial cells, consequently hindering the process of transmigration into the CNS. The second chemotaxis module involves the Chemokine receptor Cxcr3, its intracellular binding partner Gnai2, and its transcription factor Tbx21. Perturbation of this module alters the overall chemoattractive response of T cells. The third module, centered around the kinase Grk2, influences T cell egress. In vivo microscopy experiments revealed that Grk2-deficient T cells are capable of adhering to vascular endothelial cells but fail to complete the diapedesis process. Mechanistically, this impairment arises from defective S1PR1 internalization mediated by Grk2 phosphorylation. Moreover, we identified two interacting proteins, Arih1 and Ube2l3, both involved in the ubiquitination process to affect T cell migration. Lastly, we discovered that Ets1 acts as an inhibitor of T cell migration, as evidenced by the accumulation of Ets1-deficient T cells within the CNS. Collectively, our study offers valuable insights into the regulatory mechanisms underlying T cell migration in the context of EAE, thereby holding promising implications for the development of innovative therapeutic strategies.

Abstract

Multiple Sklerose (MS) ist eine autoimmune, neuroinflammatorische Erkrankung, die durch die Infiltration von Immunzellen in das zentrale Nervensystem (ZNS) gekennzeichnet ist und zu Entzündungen und anschließender Entmarkung führt, was letztendlich in der Degeneration von Neuronen endet. Die Pathogenese von MS wird hauptsächlich durch autoreaktive T-Zellen getrieben, die als erste Immunzellen in das ZNS migrieren. Obwohl Bemühungen, die Migration von T-Zellen in das ZNS zu begrenzen, teilweise erfolgreich waren, besteht weiterhin Bedarf an zusätzlichen Behandlungsoptionen. Vor diesem Hintergrund zielte diese Arbeit darauf ab, essentielle Gene zu identifizieren, die für die T-Zell-Migration in das ZNS während der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), einem Tiermodel für MS, erforderlich sind. In dieser Arbeit verwendeten wir ein EAE Modell des adoptiven T-Zell-Transfers in Lewis Ratten, um ein in vivo genomweites CRISPR/Cas9-Screening in enzephalitogenen T-Zellen durchzuführen. Durch ein anschließendes Validierungsscreening konnten wir eine Gruppe von Molekülen identifizieren, die während der initialen Phase der EAE-Pathogenese für die Migration von T-Zellen essentiell sind. Um weitere Erkenntnisse über die funktionelle Rolle dieser identifizierten Kandidaten bei der Regulation der T-Zell-Migration zu gewinnen, führten wir Validierungsexperimente mit individuellem Gen-Knockout in T-Zellen durch. Dieser Ansatz ermöglichte die Gruppierung dieser Gene in funktional kohärente Module die entscheidend zur Regulation der T-Zell-Migration beitragen. Das Adhäsionsmodul besteht aus α4-Integrin, seinem Bindungspartner β1-Integrin und dem Integrin-Chaperon Hsp90b1. Der Verlust dieser Gene führt zu einer beeinträchtigten Anheftung von T-Zellen an die endothelialen Zellen der Blutgefäße, was die Transmigration in das ZNS behindert. Das zweite Chemotaxis-Modul umfasst den Chemokinrezeptor Cxcr3, seinen intrazellulären Bindungspartner Gnai2 und seinen Transkriptionsfaktor Tbx21. Die Beeinträchtigung dieses Moduls hat Auswirkungen auf die Reaktion von T-Zellen auf chemo-taktische Signale. Das dritte Modul, das sich um die Kinase Grk2 zentriert, beeinflusst den Austritt von T-Zellen. In vivo Mikroskopie-Experimente zeigten, dass Grk2-defiziente T-Zellen in der Lage sind, an endotheliale Zellen zu binden, jedoch den Prozess der Diapedese nicht vollständig abschließen können. Mechanistisch gesehen entsteht diese Beeinträchtigung durch eine fehlerhafte Internalisierung von S1PR1, welcher von Grk2 phosphoryliert wird. Darüber hinaus identifizierten wir zwei interagierende Proteine, Arih1 und Ube2l3, die beide am Prozess der Ubiquitinierung beteiligt sind und die T-Zell-Migration beeinflussen. Schließlich entdeckten wir, dass Ets1 eine inhibitorische Rolle bei der T-Zell-Migration spielt, was sich durch die Ansammlung von Ets1-defizienten T-Zellen im ZNS zeigte. Zusammenfassend liefert unsere Studie wertvolle Erkenntnisse über die regulatorischen Mechanismen, die der T-Zell-Migration im Kontext von EAE zugrunde liegen, und hat somit vielversprechende Implikationen für die Entwicklung innovativer therapeutischer Strategien

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 15. Dezember 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Kawakami, Naoto