Whole-genome CRISPR activation screens identify regulators of E-cadherin and snail in the context of EMT

Neuner, Andrea Melanie (2023): Whole-genome CRISPR activation screens identify regulators of E-cadherin and snail in the context of EMT. Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät

Abstract

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a key process during the disease progressions of fibrosis and cancer. Controlling EMT could slow disease progression and help prevent critical steps, for instance, the tissue invasion of cancer cells. To find new factors that can control EMT, I performed two different genome-wide, dCas9-VPR-based CRISPRa screens in an A549-based cellular EMT reporter system. One CRISPRa screen was performed with a commercial wholegenome library focusing on the genes' transcription start sites. The other screen was performed with an unfocused whole-genome library produced with the CORALINA method. After identifying potential candidates by applying existing and custom-made bioinformatic methods to the next-generation sequencing data, I verified some candidates in technical validation experiments. According to database and literature searches, all candidates have been described in the context of cancer, but ASPA, LRRC75A, KCTD13, CCNJL, GCN1, ATP5L, VRK3, and ANKAR have not yet been linked directly to EMT regulation. Further, by combining different validated candidates I observed morphological changes that match EMT progression, suggesting that the identified candidates have the biological potential to impact EMT-related phenotypes.

Abstract

Epithelial-mesenchymale Transition (EMT) spielt eine wichtige Rolle im Krankheitsverlauf von Fibrose und Krebs. Durch das Kontrollieren von EMT könnte der Krankheitsverlauf verlangsamt werden. Zudem könnten kritische Krankheitsschritte verhindert werden, wie zum Beispiel die Infiltration von Gewebe durch Krebszellen. Um genetische Faktoren zu finden, die das Potential haben EMT zu kontrollieren, habe ich zwei verschiedene CRISPRa-Screening Experimente mit dem Effektorprotein dCas9-VPR durchgeführt. Dabei habe ich eine A549-basiertes, zelluläres EMT Modellsystem verwendet. In dem einen Experiment habe ich eine Sammlung von sgRNAs verwendet, die dCas9-VPR an die Transkriptionsstartpunkte im gesamten Genom bringen. Für das andere Experiment habe ich mit der CORALINA-Methode eine zufällige Sammlung von sgRNAs erzeugt, die dCas9-VPR nicht nur an Transkriptionsstartpunkte sondern auch zu inter- und intra-genetischen chromosomalen Positionen bringt. Die durch die Experimente erzeugten Sequenzierdaten habe ich mit Hilfe von bereits bestehenden als auch selbst-geschriebenen bioinformatischen Methoden ausgewertet. Die Analyse ergab mehrere Kandidaten, von denen ich einen Teil in technischen Validierungsexperimenten verifizieren konnte. In Datenbank- und Literaturrecherchen konnte ich alle Kandidaten im Kontext von Krebs finden. Manche Kandidaten, nämlich ASPA, LRRC75A, KCTD13,CCNJL, GCN1, ATP5L, VRK3 und ANKAR, wurden allerdings noch nicht im Zuge der Regulation von EMT genannt. Durch das Kombinieren von mehreren Kandidaten konnte ich morphologische Veränderungen bei A549 Zellen beobachten, die zu den zu erwartenden Veränderungen im Zusammenhang mit EMT passen. Diese Beobachtung deutet darauf hin, dass die identifizierten Kandidaten Phänotypen im Kontext von EMT biologisch beeinflussen können.

• Dokumententyp: Dissertationen (Dissertation, LMU München)
• Keywords: CRISPR, EMT, dCas9-VPR, CORALINA
• Themengebiete: 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften ; 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin und Gesundheit
• Fakultäten: Medizinische Fakultät
• Sprache der Hochschulschrift: Englisch
• Datum der mündlichen Prüfung: 28. September 2023
• 1. Bericht­erstatter:in: Stricker, Stefan